牛磺膽酸對LPS誘導的NR8383細胞分泌IL-1β的調節作用

王彩云， 張召議， 張子英,3， 關 紅， 李培鋒

(1.內蒙古農業大學獸醫學院， 內蒙古呼和浩特010018； 2.農業部動物臨床診療技術重點實驗室，內蒙古呼和浩特010018； 3.內蒙古醫科大學基礎醫學院， 內蒙古呼和浩特010110)

牛磺膽酸對LPS誘導的NR8383細胞分泌IL-1β的調節作用

王彩云1,2， 張召議1,2， 張子英1,2,3， 關 紅1,2， 李培鋒1,2

(1.內蒙古農業大學獸醫學院， 內蒙古呼和浩特010018； 2.農業部動物臨床診療技術重點實驗室，內蒙古呼和浩特010018； 3.內蒙古醫科大學基礎醫學院， 內蒙古呼和浩特010110)

為研究牛磺膽酸(Taurocholic Acid,TCA)對NR8383細胞分泌的白介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)的影響,通過實時熒光定量PCR、酶聯免疫吸附法檢測了TCA對脂多糖誘導的NR8383細胞分泌IL-1β mRNA和蛋白含量的影響。結果顯示，脂多糖(LPS)極顯著增加IL-1β mRNA和蛋白含量(P<0.01)；1 000μmol/L TCA可降低LPS誘導的NR8383細胞分泌IL-1β mRNA和蛋白含量；500μmol/L、100μmol/L的TCA可極顯著降低LPS誘導的NR8383細胞分泌IL-1β mRNA和蛋白含量(P<0.01)。結論： TCA可降低經LPS誘導的NR8383細胞分泌IL-1β基因、蛋白水平含量，隨著劑量的降低呈現劑量依賴性的抑制作用，表明TCA具有抗炎免疫調節作用。

牛磺膽酸； NR8383細胞； 白介素-1β； 調節作用

牛磺膽酸(TCA)是一種由膽酸的羧基與牛磺酸的氨基以酰胺鍵結合的初級膽汁酸，其分子式為C23(OH)3H36CONHCH2CH2SO3H，它具有利膽、解熱鎮痛、抗炎和免疫調節等多種藥理作用[1]。研究表明，TCA對急性、亞急性和慢性增生性炎癥均有顯著的抑制作用，作用機理與其抑制炎性組織中的PGE2、抑制NO和組胺的合成釋放量有關[2]。致炎劑LPS通過誘導細胞激活ERK途經參與IL-1β等基因的表達，刺激巨噬細胞發生炎性反應[3]，上述資料為TCA參與細胞的免疫調節提供了參考依據。本研究以大鼠肺泡巨噬細胞(NR8383細胞)為靶細胞，在LPS誘導后通過不同劑量的TCA作用，以NR8383細胞分泌IL-1β的mRNA和蛋白表達為切入點，揭示TCA的抗炎免疫作用及其分子作用機制，為高效利用TCA提供分子研究基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 DMEM高糖培養基(C119955 00BT，Gibco公司)；0.05%的Trypsin-EDTA(25300-054，Gibco公司)；RNAiso Plus(批號：9109，TaKaRa公司)；SYBR?Prime ExTaqTWⅡ(批號：DRR041A，TaKaRa公司)；Prime Script? RTMaster Mix(批號：RR036A，TaKaRa公司)；IL-1β ELISA試劑盒(上海依科賽公司)；TCA(T0216，SIGMA公司)；多功能酶標儀(Synergy 4，美國Bio-Tek)，低溫高速離心機(Sigma-3-30K)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 本試驗使用NR8383細胞(大鼠肺泡巨噬細胞)，于37 ℃、5% CO2培養箱中培養。當細胞匯合度達到90%時，使用0.05%胰酶進行消化并傳代。

1.2.2 RT-qPCR法 用TRIZol提取NR8383細胞中的總RNA。反轉錄反應體系：500 ng總RNA、2 μL MIX(dT)，無酶水補齊至10 μL，得到cDNA。PCR反應體系如下：模板2 μL、上游引物和下游引物各為1 μL、12.5 μL的SYBRPrime ExTaqTWⅡ，補水到25 μL，每個樣品6個重復；用2-(ΔCt)公式計算IL-1β基因的相對表達量。其中β-actin和IL-1β的引物序列見表1。

表1 β-actin、IL-1β的引物序列

1.2.3 ELISA 檢測經處理后的NR8383細胞的IL-1β含量 取經過TCA和LPS處理后的NR8383細胞上清液100 μL、生物素化抗體50 μL均加入ELISA板孔中，在37 ℃條件下孵育150 min，洗板以后加入100 μL的酶工作液，在37 ℃條件下避光孵育30 min，再次洗板以后加入100 μL顯色底物，37 ℃ 孵育15 min，最后再加入終止液100 μL，10 min內在OD450處檢測吸光值。標準品的濃度分別是1 000、500、250、125、62.5、31.25、15.625、7.3125 pg/mL和0 pg/mL。

1.3 試驗分組 不同濃度TCA對經LPS作用后NR8383細胞的IL-1β mRNA和蛋白含量影響的分組如表2所示。

表2 濃度梯度TCA對經LPS作用后NR8383細胞的IL-1β含量影響的分組

注：Control表示空白組為NR8383細胞；LPS為炎性刺激組

2 結果

2.1 IL-1β mRNA的相對qPCR擴增效率曲線 見圖1。

圖1 NR8383細胞IL-1β mRNA相對定量的熔解曲線和擴增效率曲線

注：左圖為IL-1β mRNA RT-qPCR的熔解曲線； 右圖為IL-1β mRNA RT-qPCR的擴增效率曲線， R2=99.6%，E=121.3%

圖1中左圖IL-1 β mRNA熔解曲線呈單一峰，表明產物單一,試驗數據可靠；右圖10倍濃度梯度稀釋樣品中的mRNA含量與擴增效率曲線中Ct值相關，擴增效率較好。圖1結果綜合表明RT-qPCR法可檢測IL-1 βmRNA。

2.2 不同濃度TCA對經LPS作用后NR8383細胞的IL-1 β mRNA的影響 見圖2。

圖2表明與Control組比較，LPS可極顯著增加NR8383細胞IL-1β mRNA含量(P<0.01)；與LPS組相比較，TCA1可降低LPS誘導的NR8383細胞IL-1β mRNA含量；TCA2、TCA3可極顯著降低LPS誘導的NR8383細胞IL-1β mRNA含量(P<0.01)。

圖2 不同濃度TCA對經LPS作用后NR8383細胞的IL-1β mRNA的影響

注：圖2為經LPS作用后TCA對NR8383細胞IL-1β mRNA表達量的相對值；TCA1表示1 000 μmol/L的TCA,TCA2表示 500 μmol/L 的TCA,TCA3表示100 μmol/L的TCA,Control表示空白組，：與Control組比較差異顯著P<0.05，：與Control組比較差異極顯著P<0.01；：與LPS組比較差異顯著P<0.05，：與LPS組比較差異極顯著P<0.01

2.3 不同濃度TCA對經LPS作用后NR8383細胞的IL-1β蛋白含量的影響 見圖3。

圖3 不同濃度TCA對經LPS作用后NR8383細胞的IL-1β蛋白含量的影響

注：圖3為經LPS作用后TCA對NR8383細胞IL-1β蛋白含量的影響；TCA1表示1 000 μmol/L的TCA,TCA2表示500 μmol/L的TCA,TCA3表示100 μmol/L的TCA,Control表示空白組，：與Control組比較差異顯著P<0.05，：與Control組比較差異極顯著P<0.01；：與LPS組比較差異顯著P<0.05，：與LPS組比較差異極顯著P<0.01

圖3表明，與Control組相比，LPS可極顯著增加NR8383細胞中的IL-1β蛋白含量(P<0.01)。與LPS組相比較，TCA1顯著降低LPS誘導的NR8383細胞蛋白含量(P<0.05)；TCA2、TCA3可極顯著降低LPS誘導的NR8383細胞蛋白含量(P<0.01)。

3 討論

巨噬細胞具有分泌細胞因子(IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α)和吞噬、殺傷多種病原微生物的作用[4]，是單核巨噬細胞系統的主要成員。提高巨噬細胞吞噬能力可促進免疫因子的分泌，增強免疫功能[5]。在免疫調節方面，TCA能恢復被LPS刺激和環孢菌素A抑制的TNF-和IL-1β水平，提高CD4+/CD8+淋巴細胞百分率并影響IgG分泌量[6]。上述發現為進一步研究TCA的免疫調節作用提供了依據。脂多糖(LPS)是從革蘭陰性菌外膜分離的一種強效炎性刺激劑，可誘導巨噬細胞分泌大量ILs，導致宿主快速產生反應[7]。前期研究發現LPS可以刺激細胞外調節蛋白激酶(ERK)磷酸化，且LPS使肺組織磷酸化ERK1/2表達顯著升高[8]。膽汁誘導轉染TGR5的THP-1細胞表達CAMP，抑制LPS誘導TNF-的產生[9]，TCA可能通過PKC-ERK信號通路影響NR8383細胞中LPS介導的ERK的活化，參與肺的巨噬細胞的調控[10]。由此可見作為膽汁酸的特異性受體蛋白偶聯膽汁酸受體5(TGR5)參與膽汁酸對IL-1β調節作用，提示TCA可能通過影響ERK1/2磷酸化對LPS刺激細胞所致的炎性作用。鑒于巨噬細胞的特性，結合大鼠肺臟中含較高的TGR5受體，本研究選用了大鼠肺泡巨噬細胞NR8383細胞為研究對象，通過LPS誘導后IL-1 β mRNA和蛋白的含量結果證實了上述結論，即TCA參與了大鼠肺泡巨噬細胞的抗炎免疫調節作用。為牛、羊膽汁中TCA的營養價值提供了試驗基礎，為臨床開發和應用TCA治療肺部相關疾病奠定了分子研究基礎和藥理理論依據。綜上所述，本研究可得出如下結論：1 000 μmol/LTCA降低LPS誘導的NR8383細胞分泌IL-1 β mRNA和蛋白含量(P<0.05)；500 μmol/L、100 μmol/L的TCA可極顯著降低LPS誘導的NR8383細胞分泌IL-1β mRNA和蛋白含量(P<0.01)。TCA對LPS誘導的NR8383細胞的免疫反應具有調節作用。

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Effects of TCA on the regulation ofIL-1β induced by PD98059 in NR8383 cells

WANG Cai-yun1,2,, ZHANG Zhao-yi1,2, ZHANG Zi-ying1,2,3, GUAN Hong1,2, LI Pei-feng1,2

(1.College of Veterinary Medicine,Inner Mongolia Agricultural University,Hohhot 010018,China ; 2.Key Laboratory of Clinical Diagnosis and Treatment Techniques for Animal Disease,Ministry of Agriculture,Hohhot 010018，China;3.College of Basic Medicine,Inner Mongolia Medical University，Hohhot 010110,China)

In this study we investigated the comprehensive pharmacological effects of taurocholic acids (TCA,a kind of natural bioactive substance of animal bile acids) on the production of IL-1β in NR8383 cells.The results showed that TCA had a suppressive effect on LPS induced NR8383 cells by analyzing IL-1 mRNA and protein levels using the qPCR and ELISA.The level of IL-1β mRNA and protein induced by LPS was significant (P<0.01).TCA at a concentration of 1000,500 or 100 μM significantly decreased LPS-induced production of IL-1β in NR8383 cells(P<0.01).Our findings suggest that TCA has an anti-inflammatory immune regulating effect.

TCA; NR8383 cells; IL-1β; Anti-inflammatory immune

2016-07-27

內蒙古自治區高校自然科學重點項目(NJZZ049);國家自然科學基金項目(31160487)

王彩云(1969-)，女(蒙古族)，副教授，博士,從事動物解剖學工作,E-mail：wangcaiyun688@163.com

S859.7

A

0529-6005(2016)12-0021-03