小鼠急性肝損傷中谷胱甘肽S轉移酶A1的表達分析

馬 欣 ， 劉芳萍 ， 常軼聰 ， 左詠梅 ， 趙常偉 ， 李敏敏 ， 李 睿 ， 李 植 ，藺月霞 ， 趙玉林 ， 韓 晴 ， 王德寧 ， 史晨曦 ， 赫景姍 ， 佟阿寧

(1.東北農業大學動物醫學學院 ， 黑龍江哈爾濱150030 ； 2.黑龍江省動物衛生監督所 ， 黑龍江哈爾濱150001；3.哈爾濱市道外區地方稅務局 ， 黑龍江哈爾濱150020)

小鼠急性肝損傷中谷胱甘肽S轉移酶A1的表達分析

馬 欣1， 劉芳萍1， 常軼聰1， 左詠梅2， 趙常偉1， 李敏敏1， 李 睿1， 李 植1，藺月霞1， 趙玉林1， 韓 晴1， 王德寧1， 史晨曦1， 赫景姍1， 佟阿寧3

(1.東北農業大學動物醫學學院 ， 黑龍江哈爾濱150030 ； 2.黑龍江省動物衛生監督所 ， 黑龍江哈爾濱150001；3.哈爾濱市道外區地方稅務局 ， 黑龍江哈爾濱150020)

為研究谷胱甘肽S轉移酶A1(GSTA1)在3種急性肝損傷動物模型中的表達情況， 選用雄性昆明系小鼠32只， 隨機分為4組， 包括CCl4組、APAP組、酒精組和對照組， 按本課題組前期建立的方法復制三種急性肝損傷模型。采集血清檢測轉氨酶(ALT、AST)， 肝臟檢測肝組織指標(SOD、MDA、GSH、GSH-Px)， 應用RT-PCR方法測定肝組織中GSTA1 mRNA表達量。結果顯示， 3種模型組中血清轉氨酶及肝組織指標與對照組相比差異極顯著(P<0.01)； 3種模型組中GSTA1 mRNA的表達量與對照組相比極顯著降低(P<0.01)， 其中CCl4組降低了4.9倍、APAP組降低了2.1倍、酒精組降低了3.7倍。研究表明， 在急性肝損傷中， GSTA1 mRNA的表達水平與肝損傷的程度呈負相關。

急性肝損傷 ； 小鼠 ； GSTA1 ； mRNA表達

導致肝損傷的原因有很多，目前主要研究的有化學性肝損傷、酒精性肝損傷、病毒性肝損傷和免疫性肝損傷等。谷胱甘肽S轉移酶(Glutathione S-Transferase，GST)是生物轉化II相反應中的關鍵酶，是細胞抗氧化損傷的主要代謝解毒酶系統之一。GSTA1是Alpha類GSTs家族中的重要成員[1]。本課題組前期研究表明，GSTA1可以作為肝損傷標記物[2]，同時，GSTA1具有抗氧化損傷作用，能夠保護細胞不受脂質過氧化產物的傷害，并且在代謝空氣重度污染物多環芳烴中起重要作用[3]。此外，GSTA1還具有抗腫瘤作用和細胞信號調節作用[4]。本試驗旨在分析在3種急性肝損傷模型中GSTA1的表達情況，探討其在急性肝損傷中變化的意義，為研究GSTA1在肝損傷中的重要作用及進一步研究保肝藥物提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 昆明系小鼠，體重20±2 g，雄性，清潔級，購自哈藥集團制藥總廠實驗動物中心。

1.2 3種急性肝損傷模型的復制 將32只小鼠隨機分為CCl4組、APAP組、酒精組和對照組，每組8只。試驗前小鼠隔夜禁食16 h，CCl4組小鼠按照35 mg/kg體重劑量灌胃CCl4油溶液染毒24 h，APAP組按照200 mg/kg體重劑量灌胃APAP染毒12 h，酒精組按照14 mL/kg體重劑量灌胃50%乙醇染毒8 h，對照組不做任何處理。染毒結束后各組眼球采血，制備血清檢測谷丙轉氨酶(ALT)及谷草轉氨酶(AST)；取新鮮肝臟制備肝組織勻漿，檢測丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)。

1.3 RT-PCR法檢測GSTA1 mRNA的表達水平

1.3.1 總RNA提取 取50-100 mg的新鮮肝臟，使用 TRIZol試劑提取總RNA，利用反轉錄試劑盒將所提總RNA反轉錄成cDNA待用。

1.3.2 RT-PCR分析 利用熒光定量PCR試劑盒和RT-PCR 7500系統進行GSTA1 mRNA表達測定，反應體系為20 μL，反應條件：94 °C，5 min變性，40個循環(94 °C，30 s；58 °C，40 s；72 °C，40 s),最后72 °C 5 min。以β-actin mRNA為參照，用于RT-PCR反應的引物序列如表1所示。

表1 RT-PCR引物序列

1.4 數據分析 用SPSS 17.0軟件進行單因素方差分析(Dunnett′s法統計分析)。

2 結果

2.1 3種急性肝損傷模型的復制 給予3種試劑(CCl4、APAP、酒精)后，各組小鼠未出現死亡。剖檢可見，CCl4組肝臟顏色變淺、腫脹、質地脆弱、彌漫粟粒狀小點；APAP組肝臟顏色暗淡、有散在出血點、質地脆弱易碎；酒精組肝臟顏色黯淡、易碎、被膜緊張。3個模型組中，ALT、AST和MDA均明顯升高，與對照組相比差異極顯著(P<0.01)；SOD、GSH、GSH-Px均明顯降低，與對照組相比差異極顯著(P<0.01)，見圖1及表2。

2.2 小鼠肝臟中GSTA1 mRNA的表達 三個模型組小鼠肝臟中GSTA1的mRNA表達量均明顯下降，與對照組相比差異極顯著(P<0.01)，見圖2。

CCl4組GSTA1 mRNA的相對表達量由1.32降低至0.27，與對照組相比降低了4.9倍；APAP組mRNA的相對表達量由1.32降低至0.62，降低了2.1倍；酒精組mRNA的相對表達量由1.32降低至0.36，降低了3.7倍。

圖1 血清中ALT、AST活性

**：與對照組相比差異極顯著(P<0.01)，下圖同

表2 小鼠肝組織指標變化

3 討論

本課題組前期研究表明，GSTA1比ALT更靈敏更準確，能夠在CCl4引起的急性肝損傷早期檢測到，可以作為肝損傷標記物[5]。本試驗3組急性肝損傷模型中，小鼠血清轉氨酶活性和肝組織指標均呈極顯著變化，表明模型復制成功。在CCl4模型中，GSTA1 mRNA的相對表達量極顯著下降，且該模型中各指標是3組模型中變化最大的，其原因可能是CCl4與組織高度結合，導致肝細胞中GSTA1表達受到限制，不能及時參與機體氧化應激反應、清除體內自由基，從而導致肝功能嚴重損傷。在APAP模型和酒精模型中，各指標與CCl4模型具有類似的變化趨勢，其原因可能由于APAP攝入過量，與二磷酸尿苷葡萄糖醛酸(UDPGA)和3'-磷酸腺苷-5'-磷酸硫酸酯(PAPS)結合的代謝通路飽和，多余的APAP被細胞色素P450酶系氧化生成大量具有毒性的中間產物N-乙酰苯亞胺基醌(NAPQI)，導致GSH耗竭，NAPQI與細胞內大分子不可逆共價結合，改變其結構和功能，從而造成大量肝細胞損傷及壞死[6]；大量酒精不僅加劇了自由基的產生，而且使體內抗氧化劑耗盡，造成體內的氧化應激反應，損傷細胞膜及細胞線粒體，長期慢性氧化應激會導致肝細胞死亡和肝組織損傷。

在3組急性肝損傷模型中，小鼠肝臟中GSTA1 mRNA的相對表達量均明顯下降，說明在復制模型時所使用的誘導物會抑制GSTA1的表達，阻止其參與機體氧化應激反應，從而導致肝功能嚴重受損、達到破壞肝臟的目的，由此可見，GSTA1在肝臟保護方面極為重要。在本試驗中，綜合血清轉氨酶、肝組織各指標及肝臟GSTA1 mRNA表達分析，發現了一個趨勢，CCl4導致損傷最為嚴重，其次是酒精，最后是APAP，可能是因為3種藥物與肝組織結合方式不同造成的，CCl4是親肝化工原料，可直接破壞肝細胞膜，極易導致肝細胞的變性。

本研究成功復制了3種小鼠急性肝損傷模型。GSTA1 mRNA的表達水平與肝損傷的程度呈負相關，即損傷越嚴重其表達水平越低。本試驗在基因水平上再一次證明GSTA1對于急性肝損傷模型的評價具有重要的意義，同時為進一步研究GSTA1基因調控的分子機制奠定了基礎，亦為高通量保肝藥物篩選提供了基礎理論依據。

[1] Oakley A. Glutathione transferases: a structural perspective[J]. Drug metabolism reviews, 2011, 43 (2) : 138-151.

[2] Liu F P, Lin YX, Li Z,etal.Glutathione S-transferase A1 (GSTA1) release, an early indicator of acute hepatic injury in mice[J]. Food Chem Toxicol，2014, 71:225-30.

[3] Coles B F, Kadlubar F F. Human Alpha Class Glutathione S-Transferases: GeneticPolymorp-hism, xpression, and Susceptibility to Disease[J]. Methods in enzymology, 2005, 401 : 9-42.

[4] Coles B F, Chen G, Kadlubar F F,etal. Interindividual variation and organ-specific patterns of glutathione S-transferase alpha,mu,and pi expression in gastrointestinal tract mucosa of normal individuals[J]. Arch Biochem Biophys, 2002, 403 (2) : 270-276.

[5] 劉芳萍, 韓晴, 劉穎姝, 等. GSTA1作為CCl4致小鼠急性肝損傷早期診斷指標的研究[J].中國獸醫雜志，2013, 49 (12) : 24-26.

[6] Knight T R, Kurtz A, Bajt M L,etal. Vascular and hepatocellular peroxynitrite formation during acetaminophen-induced liver injury: Role of mitochondrial oxidant stress[J]. Toxicological sciences, 2001, 8, 62 (2) : 212-220.

Expression ofglutathione S-transferase A1 in acute hepatic injury on mice

MA Xin1， LIU Fang-ping1， CHANG Yi-cong1， ZUO Yong-mei2， ZHAO Chang-wei1， LI Min-min1， LI Rui1， LI Zhi1， LIN Yue-xia1， ZHAO Yu-lin1， HAN qing1， WANG De-ning1， SHI Chen-xi1， HE Jing-shan1， TONG A-ning3

(1.College of Veterinary Medicine , Northeast Agricultural University , Harbin 150030 , China ； 2.Animal Health Supervision Institute of Heilongjiang Province ， Harbin 150001 ， China ； 3.Daowai Local Taxation Bureau of Harbin , Harbin 150020 , China)

To analyze the expression of glutathione S-transferase A1 (GSTA1) in three acute hepatic injury models, 32 male Kunming mice were randomly divided into 4 groups, CCl4, APAP, alcohol and control. Three hepatic injury models were replicated according to the methods established by our research group. Serum levels of transaminases (ALT and AST) and liver homogenate indicators (SOD, MDA, GSH and GSH-Px ) were tested and GSTA1 mRNA expression was determined by RT-PCR. The results showed that transaminases serum levels and liver homogenate indicators were significantly changed (P<0.01),and GSTA1 mRNA expression was significantly decreased (P<0.01),which were by 4.9 times (CCl4model), 2.1 times (APAP model) and 3.7 times (ethanol model). These results indicated that mRNA expression levels of GSTA1 in liver are negatively correlated with the degree of hepatic injury.

acute hepatic injury; mice; GSTA1; mRNA expression

LIU Fang-ping

2016-01-22

國家自然科學基金項目(31472241)；黑龍江省應用技術研究與開發計劃項目(PC13S03)

馬欣(1990-)，女，碩士生，研究方向為獸醫藥理學與毒理學，E-mail: 578521569@qq.com

劉芳萍，E-mail：fangpingliu@126.com

S859.7

A

0529-6005(2016)12-0102-03