氧氟沙星聯(lián)合多西環(huán)素對牛源大腸桿菌突變選擇窗的研究

李彥慶 , 張 震 , 孫冬冬 , 孫思超 , 劉 云

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院， 黑龍江哈爾濱150030)

氧氟沙星聯(lián)合多西環(huán)素對牛源大腸桿菌突變選擇窗的研究

李彥慶 , 張 震 , 孫冬冬 , 孫思超 , 劉 云

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院， 黑龍江哈爾濱150030)

研究氧氟沙星與多西環(huán)素聯(lián)用對牛源大腸桿菌耐藥突變選擇窗(MSW)及防突變濃度(MPC)的影響。該試驗通過瓊脂二倍稀釋法分別測量了氧氟沙星(OFL)及多西環(huán)素(DOX)兩藥單用及聯(lián)合用藥時牛源大腸桿菌臨床分離株E.coliⅠ、E.coliⅡ。試驗結(jié)果測得E.coliⅠ、E.coliⅡOFL單獨用藥時MSW為2.95、9.74 ，DOX單獨用藥時MSW為48.43、53.64，OFL及DOX聯(lián)合應(yīng)用時對OFL其MPC分別縮小了4倍、6倍，與8MIC濃度DOX聯(lián)用時分離株E.coliⅡMSW完全關(guān)閉。研究表明，OFL和DOX聯(lián)用，可以縮小各自單獨用藥對牛源大腸桿菌的MSW，降低其MPC，減少耐藥突變菌株產(chǎn)生。

防耐藥突變濃度； 突變選擇窗； 牛源大腸桿菌； 氧氟沙星； 多西環(huán)素

大腸桿菌(E.coli)中的一些特殊血清型，對人和動物有致病性，尤其對嬰兒和幼畜(禽)，常引起嚴重腹瀉和敗血癥。在獸醫(yī)臨床上隨著畜牧業(yè)集約化規(guī)?；a(chǎn)，當前大腸桿菌病給養(yǎng)殖業(yè)帶來的損失越來越大，其傳染性強、難于治愈、死亡率高正困擾著廣大養(yǎng)殖戶和獸醫(yī)工作者。據(jù)我們對部分牛場成年母牛和犢牛死亡病例致病菌的分離與鑒定，致病性大腸桿菌的檢出率占首位，大腸桿菌對犢牛泌乳牛均敏感，可引起犢牛腸炎、肺炎，泌乳牛腸炎、乳房炎、子宮炎等。而為了達到預(yù)期的治療效果，近年來臨床用藥不斷加大，這使得大腸桿菌抗菌譜不斷擴大，多重耐藥性大腸桿菌不斷產(chǎn)生。

隨著Zhao等提出的關(guān)于防細菌耐藥突變選擇濃度(MPC)、突變選擇窗(MSW)的新假說和新理論，臨床給藥方案有了新的思路[1-2]。傳統(tǒng)的治療方案認為藥物濃度在MIC以上就可以達到抑菌效果，但在實際應(yīng)用中，由于細菌存在自體突變，在MIC之上會發(fā)生選擇性富集[3]，因此人們希望的新的治療思路為療效好且耐藥低。當藥物濃度達到MPC以上，雖然避免產(chǎn)生耐藥突變菌株但會帶來嚴重的副作用?，F(xiàn)在提出不同作用機制的藥物聯(lián)合應(yīng)用，可以降低MPC和選擇指數(shù)(SI)甚至關(guān)閉 MSW，防止耐藥突變株產(chǎn)生。國內(nèi)外的一些研究已經(jīng)證明這點，但這些研究大都集中在人類醫(yī)學(xué)領(lǐng)域[4-5]，在獸醫(yī)領(lǐng)域研究領(lǐng)域只見豬源鏈球菌、雞源沙門菌等報道[3,5]，牛源大腸桿菌防耐藥突變濃度的報道較少。因此本試驗提出了聯(lián)合用藥方案，通過氧氟沙星與多西環(huán)素聯(lián)合應(yīng)用對牛源大腸分離E.coliⅠ、E.coliⅡ的MPC影響，研究抗菌藥物聯(lián)合應(yīng)用對牛源大腸桿菌MPC降低、MSW縮小甚至關(guān)閉的影響，為合理指導(dǎo)臨床用藥提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株 大腸桿菌標準菌株ATCC2592，購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；試驗菌株分離自黑龍江省某牛場病死犢牛肺和腸系膜。編號為E.coliⅠ、E.coliⅡ。

1.2 抗菌藥物與培養(yǎng)基 氧氟沙星(OFL)，中國食品藥品檢定研究院采購；多西環(huán)素(DOX)，購自北京奧拓達科技有限公司。Muller-Hinton(M-H)肉湯、M-H瓊脂、腦心浸液肉湯(BHI)等培養(yǎng)基，購自青島海博生物試劑有限公司。

1.3 OFL及DOX的MIC的測定 采用瓊脂倍比稀釋法分別測定氧氟沙星和多西環(huán)素對牛源大腸桿菌的MIC值。標準大腸桿菌ATCC 2592為質(zhì)控菌株、按CLSI 2013年標準判斷，并記錄結(jié)果。計算MIC值。

1.4 OFL及DOX的MPC的測定

1.4.1 單藥平板的配置 以各菌株的MIC為基準，采用倍比稀釋法配置不同濃度的含藥M-H平板，每個濃度4個平板，用以測定MPC。

1.4.2 兩藥平板的配置 以各藥的MPC為標準呈線性20%遞減至1/2MPC以簡化棋盤法交叉配置含藥M-H平板，每個濃度4個平板，用以測定聯(lián)合MPC。

1.4.3 MPC的測定 按照Zhao[4]等方法加以改進，使菌液濃度達到3×1010CFU/mL，取0.1 mL 制備好的菌懸液均勻涂抹在各含藥瓊脂平板上,37 ℃恒溫培養(yǎng)72 h，每隔 24 h觀察1次細菌生長情況。培養(yǎng)72 h后無細菌生長的最低藥物濃度定義為暫定 MPC(MPCpr)。再以MPCpr為基線，線性遞減(20%)藥物濃度，以不出現(xiàn)細菌生長的最低藥物濃度為MPC。

1.4.4 聯(lián)合指數(shù)測量 藥物平板按照兩藥16倍MIC到1/4MIC交叉棋盤法配置96孔板，藥物與菌液比為1:9制備好的菌懸液蓋好蓋子放置于37 ℃普通恒溫培養(yǎng)箱中，孵育16～20 h判斷結(jié)果。并計算FIC、SI。

2 結(jié)果

2.1 OFL與DOX單獨及聯(lián)合用藥MIC、MPC、SI測定結(jié)果 本試驗通過瓊脂倍比稀釋法及瓊脂平板二倍稀釋分別測定了OFL、DOX及復(fù)方OFL/DOX對大腸桿菌標準菌株E.coliⅠ、E.coliⅡ的MIC、MPC、SI如表1，2。

表1 OFL、DOX及復(fù)方OFL/DOX對E.coliⅠ、E.coliⅡ分離株的MIC值得測定結(jié)果

表2 OFL、DOX及復(fù)方OFL/DOX對E.coliⅠ、E.coliⅡ分離株的MPC、SI值得測定結(jié)果

2.2 OFL與DOX聯(lián)用縮小牛源大腸桿菌MSW結(jié)果 OFL與DOX聯(lián)用縮小牛源大腸桿菌對分離株E.coliⅠ的MSW結(jié)果顯示，當DOX濃度小于MIC時，OFL的MPC沒有減小，當DOX濃度增加至2MIC時，OFL的MPC降低至原來的1/4，但隨著DOX濃度增加，OFL的MPC不再降低(表3)。

表3 OFL與DOX縮小牛源大腸桿菌分離株E.coli Ⅰ的MSW

OFL與DOX聯(lián)用縮小牛源大腸桿菌對分離株E.coliⅡ的MSW結(jié)果顯示，當DOX濃度小于MIC時，OFL的MPC沒有減小，當DOX濃度增加至4MIC時，OFL的MPC降低至原來的1/6，當DOX濃度增加至8MIC，OFL的MSW完全關(guān)閉(表4)。

表4 OFL與DOX縮小牛源大腸桿菌分離株E.coliⅡ的MSW

“+”有耐藥突變體生長；“-”無耐藥突變體生長

3 討論

目前，基于最小抑菌濃度(Minimum inhibitory concentration ，MIC)的傳統(tǒng)治療法案，可以抑制或殺死大部分敏感細菌，但會誘使耐藥突變菌株產(chǎn)生和優(yōu)勢生長[6]。但是這種治療方案并沒有抑制細菌耐藥性的產(chǎn)生，因此尋找一種新的治療策略使在控制細菌感染的同時還可以防止耐藥突變菌株的產(chǎn)生變得十分重要。隨著MSW理論研究的深入，針對突變選擇窗(MSW)理論，提出兩種給藥方案[2,7]，一種是使血藥濃度迅速達到MPC及以上，防止耐藥突變菌株的產(chǎn)生，但是此方法勢必要增大給藥濃度帶來嚴重的毒副作用。另一種給藥方案為通過兩種不同作用機制的抗菌藥物的聯(lián)合應(yīng)用，使兩種藥物的MSW縮小甚至關(guān)閉，降低兩種藥物的MPC，既防止了耐藥突變菌株的產(chǎn)生又維持正常的給藥濃度，減少了副作用的產(chǎn)生，是現(xiàn)在最優(yōu)的給藥方案。并且有大量的研究已經(jīng)證明兩種不同作用機制的藥物聯(lián)合應(yīng)用可以減小MPC，縮小MSW[8-9]。

本試驗通過OFL對兩株牛源大腸桿菌用藥，研究測定OFL與DOX單獨及聯(lián)合用藥時其MPC及MSW的變化，單獨用藥時MPC為其MIC的12.8、20.48倍，如果使其血藥濃度達到MPC濃度以上，會對機體產(chǎn)生嚴重的毒副作用。因此，臨床上加大給藥濃度使其血藥濃度保持在MPC以上并不可行。聯(lián)合用藥時，測得兩種藥物的MIC結(jié)合藥物動力學(xué)參數(shù)，這兩種藥物的Cmax均小于MPC，落在MSW中，容易產(chǎn)生耐藥突變菌株，因此應(yīng)避免單獨用藥。

試驗表明，當藥物濃度低于MIC時，不能降低各藥的MPC，減小各藥的MSW，細菌只要克服一種選擇壓力即可，此時相當于單獨用藥，所以必須時兩種藥物濃度同時大于MIC值，各藥物濃度大于MIC時，細菌需要克服兩種選擇壓力才能生長，所以可以使各藥的MPC成倍減小，大幅度縮小MSW，降低了突變菌株產(chǎn)生概率。SI可以反映限制耐藥菌株突變選擇的能力，SI越小，說明該藥物抑制細菌突變能力越強，聯(lián)合用藥SI也從12.8～20.48降低到8.19～16.38，且OFL及DOX聯(lián)合應(yīng)用時對OFL其MPC分別縮小了4倍、6倍，與8MIC濃度DOX聯(lián)用時分離株E.coliⅡ號MSW完全關(guān)閉。這表明通過選擇不同作用機制的抗菌藥物聯(lián)合應(yīng)用，可達到抗菌藥物在安全劑量下，既殺滅敏感菌又限制耐藥菌株富集生長的理想效果。如果想知道對于牛源大腸桿菌對于其他聯(lián)合用藥效果尚需進一步研究。

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Narrowing mutant selection window of cattle Escherichia coli by combined ofloxacin with doxycycline

LI Yan-qing， ZHANG Zhen， SUN Dong-dong， SUN Si-chao， LIU Yun

(College of veterinary medicine ，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China)

The study investigated whether ofloxacin and doxycycline combination was able to narrow mutant selection window (MSW) and mutant prevention concentration (MPC) of a single drug group for cattleEscherichiacoli.Based on MIC determination of the ofloxacin (OFL) and doxycycline (DOX)，anti-mutation concentration and mutant selection window of both single and combined drugs for the clinically isolated strains ofE.coliⅠ andE.coliⅡ.The results showed when OFL was used alone,MSW was 2.95，and 9.74.When DOX was used alone,MSW was 48.43 and 53.64，when OFL and DOX were used together.The MPC of OFL was reduced 4-fold and 6-fold.When OFL combined with 16 MIC DOX，the standard strain MSW was completely shut down，and when OFL combined with 8 MIC DOX，MSW of the isolatedE.coliⅡwas shut down.This study shows that OFL combined with DOX reduces the MSW and MPC of the single agent for cattleE.coli，and reduce the resistance mutation.

mutant prevention concentration; mutant selection window;E.coli; ofloxacin; doxycycline

LIU Yun

2016-01-29

黑龍江省自然科學(xué)基金(面上項目)(C2015020)

李彥慶(1989-)，女，碩士，主要從事臨床獸醫(yī)方向，E-mail:1329756276@qq.com

劉云，E-mail:abliuyun@yeah.net

R378.2+1

A

0529-6005(2016)12-0038-03