幾種蒲公英成分的提取及體外抑菌效果試驗(yàn)

侯京玲 ， 周霄楠 ， 趙興華 ， 鐘秀會(huì)

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 ， 河北保定071001)

幾種蒲公英成分的提取及體外抑菌效果試驗(yàn)

侯京玲 ， 周霄楠 ， 趙興華 ， 鐘秀會(huì)

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 ， 河北保定071001)

研究蒲公英不同成分的抑菌效果，通過水提、醇提、超聲波提取法等提取蒲公英多糖、蒲公英黃酮、蒲公英酚酸，并利用平板打孔法研究各提取物對(duì)沙門菌、痢疾桿菌、大腸桿菌、葡萄球菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果。結(jié)果表明，蒲公英多糖對(duì)這5種菌均未見抑制效果。蒲公英黃酮對(duì)痢疾桿菌、大腸桿菌、葡萄球菌和金黃色葡萄球菌有抑制作用，對(duì)沙門菌未見抑菌性。蒲公英酚酸對(duì)以上5種菌均顯示抑制作用。

蒲公英多糖 ； 蒲公英黃酮 ； 蒲公英酚酸 ； 抑菌作用

畜禽養(yǎng)殖生產(chǎn)中抗生素廣泛應(yīng)用。但是，大量應(yīng)用抗生素可使畜禽體內(nèi)的微生物產(chǎn)生耐藥性，同時(shí)造成畜產(chǎn)品中抗生素藥物殘留，影響動(dòng)物源性食品安全。因此，在養(yǎng)殖過程中減少抗生素的使用勢(shì)在必行，農(nóng)業(yè)部最近表示，為提升消費(fèi)者對(duì)畜牧產(chǎn)品的信賴，擬計(jì)劃全面禁止在動(dòng)物飼料中添加抗生素。并于2015年制訂了抗生素治理5年規(guī)劃。許多研究都在致力于尋找抗生素的替代品。中藥一直為保障畜牧健康養(yǎng)殖發(fā)揮著巨大作用，且中藥沒有化學(xué)藥物的耐藥性等弊端，因此受到許多學(xué)者的重視。

蒲公英作為清熱解毒類藥物被許多學(xué)者所關(guān)注。蒲公英味苦、甘，性寒，具清熱解毒，消腫散結(jié)，利尿通淋之功效。用于疔瘡腫毒、乳癰、瘰疬、目赤、咽痛、肺癰、腸癰、濕熱黃疸、熱淋澀痛。醫(yī)學(xué)研究表明，蒲公英具有廣譜抑菌作用，對(duì)革蘭陽性和革蘭陰性菌、皮膚真菌、螺旋體均有不同程度的抑制作用，且不易產(chǎn)生耐藥性。對(duì)金黃色葡萄球菌、溶血性鏈球菌、表皮葡萄球菌、卡他球菌等具有較強(qiáng)的殺滅作用，對(duì)幽門螺桿菌、痢疾桿菌、變形桿菌、沙門菌等臨床常見感染菌也有不同程度的抑制作用[1]。目前，對(duì)蒲公英抗菌活性的研究多以藥材粗提物或不同極性部位的提取液為研究對(duì)象，對(duì)單一抑菌成分的研究較少。如孫繼梅[2]等利用水煎法提取蒲公英活性成分，進(jìn)行體外抑菌試驗(yàn)，試驗(yàn)表明，蒲公英在體外對(duì)臨床常見感染菌，尤其是革蘭陽性、革蘭陰性球菌有較好的抑菌活性。孫長(zhǎng)霞[3]等采用不同溶劑提取蒲公英的有效成分并進(jìn)行體外抑菌試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果顯示，蒲公英水提物及醇提物均具有抑菌作用。蒲公英的抑菌活性成分包括多糖類、酚酸類、黃酮類、植物甾醇類、倍半萜內(nèi)酯類。早期研究多集中在以綠原酸為代表的有機(jī)酸類的抑菌活性方面，近年來研究范圍逐漸擴(kuò)展到多糖類、黃酮類成分。吳杰[4]利用水提醇沉法提取蒲公英的多糖，脫蛋白處理后，進(jìn)行抑菌試驗(yàn)研究，試驗(yàn)結(jié)果顯示，蒲公英多糖對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌均具有明顯的抑菌作用。李華峰[5]對(duì)蒲公英花不同提取部位的抗菌活性進(jìn)行研究，表明乙酸乙酯相抗菌活性顯著高于水相和石油醚相，進(jìn)一步說明了黃酮類化合物是其抑菌主要成分。

盡管蒲公英在世界各地均大量分布，但作為天然藥物為大眾所廣泛使用甚至世界各國(guó)所接受，尚需做很多基礎(chǔ)研究。本試驗(yàn)采用水提醇沉法、超聲波提取法等方法提取蒲公英的3種成分：蒲公英多糖、蒲公英黃酮和蒲公英酚酸。并測(cè)定了這3種成分對(duì)5種致病細(xì)菌的抑菌效果，旨在為開發(fā)和研制新型中藥抑菌劑，拓寬蒲公英的使用范圍，提供基礎(chǔ)資料和參考。

1 材料與方法

1.1 中藥蒲公英飲片樣品(購(gòu)自河北省保定市安國(guó)中藥材市場(chǎng)) 培養(yǎng)基：營(yíng)養(yǎng)肉湯瓊脂培養(yǎng)基(北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司)。菌種：沙門菌、痢疾桿菌、大腸桿菌、葡萄球菌和金黃色葡萄球菌。菌種由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 蒲公英多糖的提取 稱取干燥蒲公英100 g，粉碎過40目篩備用置于圓底燒瓶中，加石油醚回流兩次，每次1 h，脫去脂肪。然后用 80%乙醇回流，以除去樣品中的單糖、寡糖以及其他小分子物質(zhì)。加入蒸餾水3 000 mL，80 ℃提取3 h，抽濾，重復(fù)2次，合并濾液。Sevage法向提取液中加入1/4體積的氯仿-正丁醇(v/v4∶1)混合20 min，3 500 r/min離心5 min，去除中層白色絮狀蛋白質(zhì)沉淀，取上清，反復(fù)5、6次，至中間無沉淀為止。脫蛋白完畢后向提取液中緩緩加入95%乙醇，并用玻璃棒緩慢攪拌，使乙醇濃度達(dá)到80%，靜置4 h，4 000 r/min離心5 min，沉淀得粗多糖。離心沉淀物，離心洗滌數(shù)次，即得蒲公英多糖[6]。根據(jù)蒽銅-硫酸法[7]檢測(cè)蒲公英多糖的含量。

1.3 蒲公英黃酮的提取 取干燥蒲公英干粉100 g，在乙醇體積分?jǐn)?shù)65%，料液比1:35，超聲時(shí)間35 min，超聲溫度60 ℃條件下，提取4次。然后抽濾，得黃酮提取液[8]。

大孔樹脂D101濕法灌柱2/3，保持柱子濕潤(rùn)，在上1/3上樣，樣品的pH值為3，濃度液料比為3:1即300 mL，先用蒸餾水洗脫，再用40%～70%的乙醇洗脫，蒸餾水洗脫液棄去，收集乙醇洗脫液，用三氯化鐵檢驗(yàn)洗脫液成灰綠色時(shí)收集，再將洗脫液濃縮得到黃酮濃縮液，將黃酮濃縮液放到100 ℃恒溫水浴鍋中加熱，得黃酮粗品[9]。根據(jù)紫外分光光度計(jì)法測(cè)量蒲公英黃酮含量[10]。

1.4 蒲公英中酚酸的提取 準(zhǔn)確稱取100 g干燥蒲公英粉末，平均放入兩個(gè)500 mL圓底燒瓶中，按1∶14的料液比添加60%乙醇，調(diào)節(jié)pH值到2，然后置超聲波提取器中，超聲溫度為50 ℃超聲提取50 min，取出，抽濾得濾液[11]，濃縮濾液使得濃度為料液比1∶3，即為300 mL，然后過柱(柱子同上1.2.2，樹脂為DA-201大孔樹脂，洗脫液為80%乙醇[12])，用三氯化鐵檢驗(yàn)洗脫液呈深綠色時(shí)收集，收集洗脫液后濃縮得酚酸浸膏。根據(jù)紫外分光光度計(jì)法測(cè)量蒲公英酚酸含量[13]。

1.5 黃連水提物的制備 準(zhǔn)確稱取100 g干燥的黃連飲片，加入適量的蒸餾水煎煮1 h，過濾，反復(fù)3次，濃縮濾液，得到1 g/mL的水提物，備用。

1.6 菌種活化培養(yǎng)和菌液的制備 將沙門菌、痢疾桿菌、大腸桿菌、葡萄球菌和金黃色葡萄球菌分別接種到營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)24 h后，用比濁法將各菌株用無菌水配制成106CFU/mL菌懸液，備用。

1.7 體外抑菌試驗(yàn) 在超凈工作臺(tái)上向牛肉膏蛋白胨平板中加入0.2 mL細(xì)菌的菌懸液，L型涂布器涂布均勻。用打孔器在培養(yǎng)基上等距打5個(gè)孔，孔中分別滴入1 g/mL的蒲公英提取物、蒸餾水和黃連水提物。其中蒸餾水作為陰性對(duì)照，黃連1 g/mL水提物為陽性對(duì)照。重復(fù)3次，計(jì)算平均抑菌圈直徑。

2 結(jié)果

2.1 蒲公英有效成分的含量測(cè)定結(jié)果 100 g蒲公英全草中得到蒲公英多糖的干物質(zhì)6 g，含量為 25.3%；蒲公英黃酮的粗品4.25 g，含量為3.4%；蒲公英酚酸浸膏17.37 g，含量為3.2%。

2.2 蒲公英3種成分的抑菌效果 蒲公英多糖對(duì)金黃色葡萄球菌、沙門菌、大腸桿菌、葡萄球菌、痢疾桿菌這5種菌均未顯示抑制效果。蒲公英黃酮對(duì)沙門菌未見抑菌性，對(duì)其他4種菌均顯示不同程度的抑菌性。蒲公英酚酸對(duì)以上5種菌具有不同程度的抑菌效果，其中蒲公英酚酸的抑菌效果最強(qiáng)。黃連水提物作為陽性對(duì)照藥物，在本試驗(yàn)中，僅對(duì)2種葡萄球菌和大腸桿菌表現(xiàn)出抑菌效果。見表1.

3 討論

蒲公英在全國(guó)大部分地區(qū)均有分布，共有70余種，其中以蒙古蒲公英分布最廣，臨床上應(yīng)用也最多?，F(xiàn)代藥理研究表明，蒲公英具有廣譜抑菌作用，對(duì)革蘭陽性菌、革蘭陰性菌、真菌均有效且不產(chǎn)生耐藥。蒲公英還有利膽保肝[14]，抗內(nèi)毒素，健胃和免疫促進(jìn)等作用[15]。

表1 蒲公英不同提取物對(duì)5種菌的抑菌圈直徑 (mm)

近年關(guān)于蒲公英抑菌作用的研究很多，以蒲公英提取物為最，但多數(shù)并沒有明確的鑒定蒲公英提取物中何種成分有抑菌作用。宋曉勇[16]等采用紙片法和瓊脂稀釋法考察了蒲公英多糖的抗菌活性，結(jié)果顯示，蒲公英多糖抑菌活性良好，對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、沙門菌、鏈球菌均有不同程度的抑制作用。蒲公英寡糖也對(duì)大腸桿菌和葡萄球菌等顯示抑菌作用[17]。蒲公英的醇提物對(duì)金黃色葡萄球菌等具抑菌活性，似乎與所含酚酸有關(guān)。本試驗(yàn)對(duì)蒲公英的3種主要活性成分進(jìn)行了初步鑒定和抑菌效果研究。結(jié)果顯示，蒲公英多糖對(duì)金黃色葡萄球菌、沙門菌、大腸桿菌、葡萄球菌、痢疾桿菌這5種菌均未顯示抑制效果。蒲公英黃酮對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、葡萄球菌、痢疾桿菌均具有一定的抑制作用，且對(duì)葡萄球菌的抑制作用最強(qiáng)。蒲公英酚酸對(duì)以上5種菌具有抑菌效果，且對(duì)葡萄球菌的抑制作用最強(qiáng)。本研究結(jié)果中，蒲公英多糖未顯示抑菌效果，與上述文獻(xiàn)報(bào)道[16]結(jié)果并不一致，這是否因?yàn)楸狙芯康奶崛》椒ú煌?，有待繼續(xù)試驗(yàn)驗(yàn)證。

蒲公英的主要活性成分是多糖類、黃酮類、有機(jī)酸和甾醇類物質(zhì)，經(jīng)初步鑒定有機(jī)酸為綠原酸。蒲公英中多糖含量豐富、提取簡(jiǎn)單，在抗氧化、抗腫瘤、抗疲勞、降糖等方面具有很好的研究意義。蒲公英黃酮資源廣、提取方便、抗氧化作用顯著具有良好應(yīng)用前景。綠原酸具有廣譜抗菌和利膽作用，是蒲公英抗菌的主要有效成分。近年國(guó)內(nèi)外學(xué)者中有很多關(guān)于綠原酸抑菌的研究。中藥的提取方法決定了藥液的成分和含量，提取劑的選擇直接影響藥物有效成分的含量，從而影響藥物的作用效果[18]。蒲公英水提物在體內(nèi)通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路，對(duì)于LPS誘導(dǎo)的小鼠肺炎顯示出抗炎作用[19]。中藥抑菌有效成分在體內(nèi)和體外的作用存在差異，其原因尚待深入研究。

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Research on Antibacterial Activity of different Herba Taraxaci extracts in Vitro

HOU Jing-ling , ZHOU Xiao-nan , ZHAO Xing-hua , ZHONG Xiu hui

(AgriculturalUniversity of Hebei, College of Veterinary Medicine, Baoding 071001, China)

Water extraction, alcohol extraction,and ultrasonic extraction methods were used to extract the polysaccharides,phenolic acids,and flavonoids from dandelion. Disk diffusion method was adopted to study the bacteriostatic effect of Taraxacum extraction onSalmonella,Dysenterybacillus,Escherichiacoli,Staphylococcus,andStaphylococcusaureus. The results showed that Dandelion polysaccharide had no inhibitory effect on the five kinds of bacteria. Dandelion flavonoids had bacteriostasis todysenterybacillus,Escherichiacoli,staphylococcus, andstaphylococcusaureus,while had no bacteriostasis to Salmonella. Dandelion phenolic acids had inhibitory effect on the above five kinds of bacteria.

Dandeloin; Dandelion polysaccharide; Dandelion flavonoids; Dandelion phenolic; bacteriostasis

ZHAO Xing-hua

2015-12-02

河北省教育廳高等學(xué)?？茖W(xué)技術(shù)研究?jī)?yōu)秀青年基金項(xiàng)目(YQ2013019)；河北省科技計(jì)劃項(xiàng)目(13226624)

侯京玲(1986-)，女，碩士，研究方向?yàn)橹兴幩幚韺W(xué)， E-mail:15232973536@163.com

趙興華，E-mail:dyzhaoxh@hebau.edu.cn

R285.5

A

0529-6005(2016)12-0053-03