鈣激活氯通道蛋白ANO1在小鼠主動脈平滑肌細胞的表達及其功能鑒定

張雲喬， 王 勝， 劉艷杰， 崔 爽， 曲 適， 王鑫鑫， 龍 嘯， 方 芳， 郝 峰

(1.吉林醫藥學院生物化學檢驗教研室， 吉林吉林132013 ； 2.吉林省腫瘤醫院， 吉林長春130021 ；3.吉林醫藥學院附屬醫院， 吉林吉林132013 ； 4.重慶探生科技有限公司， 重慶九龍坡400039)

鈣激活氯通道蛋白ANO1在小鼠主動脈平滑肌細胞的表達及其功能鑒定

張雲喬1， 王 勝2， 劉艷杰3， 崔 爽1， 曲 適1， 王鑫鑫1， 龍 嘯4， 方 芳1， 郝 峰1

(1.吉林醫藥學院生物化學檢驗教研室， 吉林吉林132013 ； 2.吉林省腫瘤醫院， 吉林長春130021 ；3.吉林醫藥學院附屬醫院， 吉林吉林132013 ； 4.重慶探生科技有限公司， 重慶九龍坡400039)

探討鈣激活氯通道蛋白ANO1在C57BL/6小鼠主動脈平滑肌細胞中的表達及其功能特性。運用膠原酶消化法獲得原代培養的小鼠主動脈平滑肌細胞，流式細胞術檢測平滑肌細胞純度；應用RT-PCR檢測主動脈平滑肌細胞ANO1 mRNA的表達；免疫印跡檢測ANO1蛋白在主動脈平滑肌細胞的表達情況；應用熒光淬滅動力學實驗檢測ANO1鈣激活氯通道的功能特性。原代培養成功獲得主動脈平滑肌細胞；RT-PCR結果分析表明，主動脈平滑肌細胞在mRNA水平有ANO1表達；免疫印跡顯示主動脈平滑肌細胞蛋白水平有ANO1表達；熒光淬滅動力學實驗證實表達在主動脈平滑肌細胞的ANO1具有陰離子轉運功能，即鈣激活氯通道典型特性。小鼠主動脈平滑肌細胞表達的ANO1是鈣激活氯通道的分子基礎。

ANO1蛋白；鈣激活氯離子通道；小鼠；主動脈平滑肌細胞

高血壓是心腦血管疾病的第一危險因素。血管平滑肌細胞上的離子通道是血管正常收縮舒張來維持血壓的重要因素[1]。Cl-是細胞外液主要陰離子，通過跨膜轉運和陰離子通道蛋白參與多種生理功能。目前研究發現Anoctamin-1 ( ANOl ) 能夠編碼CaCCs[2～4]。因此以小鼠主動脈平滑肌細胞作為研究對象，應用分子生物學、免疫熒光化學方法以及熒光淬滅動力學實驗，明確ANOl 在主動脈平滑肌細胞的表達，為深入研究該通道功能、明確該通道與高血壓的發病機制及靶向治療提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與主要試劑 C57BL/6小鼠由吉林大學第二醫院實驗動物中心提供。兔抗鼠α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)單克隆抗體，購自BD公司；anti-ANO1單克隆抗體及HRP標記羊抗兔IgG，購自SANTA CRUZ公司；ionomycin和T16Ainh-A01，購自Millipore公司；Lipofectamine LTX，購自Invitrogen公司；pcDNA3.1-YFP-H148Q/I152L為本實驗室前期構建。

1.2 方法

1.2.1 主動脈平滑肌細胞培養及形態學觀察和鑒定 采用組織塊法與膠原酶消化法聯合收集主動脈平滑肌細胞[5]，10%胎牛血清的DMEM/F12培養液于37 ℃、5% CO2環境下培養3 d，倒置顯微鏡觀察細胞形態，流式細胞術檢測平滑肌細胞純度。

1.2.2 逆轉錄-多聚酶聯反應( RT-PCR )檢測AN O1表達 應用TRIZol提取RNA。以總RNA為模板，逆轉錄為cDNA，PCR擴增。參照文獻[4]合成ANO1引物序列：上游5′- GGACCTGGGCTATGAGGTTCAG-3′，下游5′-CAGCGCGTCCCCATGGTACTC-3′。內參β-actin 引物序列：上游5′-CATCCTGCGTCTGGACCTG-3′，下游5′-ATCTCCTTCTGCATCCTGTC-3′。RT-PCR產物進行2%瓊脂糖凝膠電泳。

1.2.3 免疫印跡檢測ANO1蛋白的表達 按照BCA蛋白質定量方法測定蛋白質濃度。SDS-PAGE凝膠電泳后轉至PVDF膜，封閉2 h，加ANO1單克隆抗體(1∶100)4 ℃過夜。漂洗后加入二抗(1∶500)孵育1 h。繼續洗膜，加入底物室溫孵育 1 min。采集圖像后分析ANO1蛋白的表達。

1.2.4 熒光淬滅動力學實驗鑒定ANO1功能 96孔板中細胞數為20 000/孔，培養24 h。將脂質體和pcDNA3.1-YFP-H148Q/I152L加入96孔板，36 h后加入含有5μmol/L ionomycin的高I-溶液，多功能酶標儀動態檢測熒光淬滅情況并獲取動態曲線。以ANO1特異抑制劑T16Ainh-A01(10 μmol/L)溶液及不含ionomycin高I-溶液作為對照。

2 結果

2.1 主動脈平滑肌細胞分離與培養和鑒定 采用組織塊與膠原酶消化法聯合，結果顯示，獲得較多的C57BL/6小鼠原代主動脈平滑肌細胞，胞體較小，呈較規則梭形，貼壁良好，見圖 1。流式細胞術檢測上述細胞表面標記分子α-SMA表達，抗體染色陽性的細胞為平滑肌細胞，統計分析平滑肌細胞比例為98.7%，見中插彩版圖2。

圖1 原代培養主動脈平滑肌細胞形態 (×200)

2.2 主動脈平滑肌細胞ANO1的mRNA表達 RT-PCR結果表明，在400 bp附近出現特異性條帶，與預期的目的片段大小相符，見圖3。證實經原代分離培養的小鼠主動脈平滑肌細胞在mRNA水平上有ANO1穩定表達。

圖3 主動脈平滑肌細胞的RT-PCR檢測結果

2.3 ANO1蛋白在小鼠主動脈平滑肌細胞的表達 小鼠ANO1蛋白大小為150 kD，根據Western-Blot結果顯示，主動脈平滑肌細胞提取蛋白在分離膠相應位置上可見預期大小的清晰條帶，證明小鼠主動脈平滑肌細胞在蛋白水平表達有ANO1，見圖4。

圖4 主動脈平滑肌細胞ANO1蛋白的表達

2.4 主動脈平滑肌細胞ANO1的功能特性鑒定 實驗結果顯示，加入Ionomycin使熒光強度迅速下降(見圖5A)，表明ANO1具有CaCCs內向轉運I-的功能，其激活與鈣離子密切相關。加入ANO1特異抑制劑，熒光強度無明顯變化，進一步明確主動脈平滑肌細胞內流的碘是通過ANO1實現的(見圖5B)。上述結果一致表明，表達于ANO1具有鈣激活和轉運碘離子的特性，符合經典CaCCs特性。

圖5 YFP H148Q/I152L鑒定ANO1功能A：穩定表達ANO1的細胞加入Ionomycin熒光猝滅； B：對照組

3 討論

研究表明，離子通道與血管張力的產生和調節密切相關[4]。Cl-通道作為主要的陰離子通道，開放可導致Cl-外流，驅動膜電位向ECl方向靠近，形成膜的去極化從而引起平滑肌的收縮，對血管收縮反應具有重要的調節作用。目前研究認為，氯通道結構的改變和功能的紊亂可導致原發性高血壓，因此氯通道將成為高血壓研究領域的新焦點、治療的新靶點。

血管平滑肌細胞主要存在兩種陰離子通道，即容積調節的Cl-通道和Ca2+激活Cl-通道[6-7]。其中 CaCCs可以被細胞膜電位去極化和細胞內游離鈣離子濃度升高所激活，造成平滑肌細胞收縮，血管張力增大，對心血管疾病的發生、發展起到重要調節作用。但是由于CaCCs的分子基礎長期未得到證實，導致CaCC的分子結構與功能和疾病之間的關系等研究都無法深入展開。直到2008年Nature、Science和Cell同時報道：CaCCs通道是由ANO1蛋白構成[2]，這一發現為特定細胞和組織中研究氯離子通道的生理病理相關問題及其作用機制提供了新的研究平臺。本實驗以小鼠原代培養的主動脈平滑肌細胞為研究對象，在mRNA和蛋白水平證實小鼠主動脈平滑肌細胞存在 ANO1 的表達，并應用功能試驗證實ANO1 確具有 CaCCs 通道的功能特性。因此，認為主動脈平滑肌細胞表達ANO1蛋白，并且發揮內源性 CaCCs作用。本研究結果為深入探討血管平滑肌細胞CaCCs在高血壓形成機制中的作用，及臨床高血壓病的防治研究提供基礎。目前推測CaCCs可能是引起、維持較高血管張力和外周血流阻力的因素之一，阻斷CaCCs通道可引起外周血管舒張，激活CaCCs通道則引起外周血管收縮，CaCCs在外周血管平滑肌細胞張力的產生、維持及調節方面起著重要作用[4]。總之，隨著對CaCCs研究的不斷深入，其生理學和藥理學特點及其在動脈張力中的作用會被逐漸揭示，為高血壓等心血管疾病的研究提供新方向和線索。

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[3] Pedemonte N，Galietta L J．Structure and function of TMEM16 proteins (anoctamins)[J]．Physiol Rev，2014，94(2)：419-459．

[4] Picollo A，Malvezzi M，Accardi A．TMEM16 proteins: unknown structure and confusing functions[J]．J Mol Biol，2015，427(1)：94-105．

[5] 姜勇，張鑫，蘇瑞，等．大鼠血管平滑肌細胞的原代培養及誘導分化研究[J]．南京大學學報，2009，45(4)．

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2016-03-18

吉林省衛生計生科研計劃(2014Z103)；吉林省教育廳基金資助(2013-351)；國家自然科學基金資助項目(81202031)；2016年吉林醫藥學院國家級大學生創新創業訓練計劃(NO.201613706020)

張雲喬(1993-)，女，本科，主要從事離子通道的結構和功能研究，E-mail：1017794752@qq.com

郝峰，E-mail:haof863@126.com

R337.5

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0529-6005(2016)12-0087-02