鹽酸沃尼妙林與豬雞兔血漿蛋白結(jié)合率的檢測和比較

周文杰 ， 周宇峰 ， 李 曉 ， 何杰舜 ， 劉雅紅 ， 孫 堅

(華南農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)學院 ， 廣東廣州510642)

鹽酸沃尼妙林與豬雞兔血漿蛋白結(jié)合率的檢測和比較

周文杰 ， 周宇峰 ， 李 曉 ， 何杰舜 ， 劉雅紅 ， 孫 堅

(華南農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)學院 ， 廣東廣州510642)

本試驗采用超濾法結(jié)合高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)測定沃尼妙林與豬、雞和兔血漿蛋白結(jié)合率，并對血漿中不同濃度沃尼妙林的蛋白結(jié)合率進行比較。結(jié)果表明，建立的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法用于沃尼妙林生物樣品的測定具有簡便、靈敏與選擇性高的特點。沃尼妙林具有較強的血漿蛋白結(jié)合率，其在豬、雞和兔血漿中的平均蛋白結(jié)合率分別為84.4%±1.07%，87.5%±1.83%和86.6%±1.96%。沃尼妙林的血漿蛋白結(jié)合率在0.1～10 μg/mL的考察濃度范圍內(nèi)無顯著性差異，蛋白結(jié)合呈現(xiàn)非濃度依賴的特性。

沃尼妙林；血漿蛋白結(jié)合率；超濾法；HPLC-MS/MS

沃尼妙林是新一代獸醫(yī)專用的截短側(cè)耳素(pleuromutilin)類半合成抗生素，因其抗菌譜廣、吸收快、分布廣、毒性小、殘留低，且不易產(chǎn)生耐藥性等特點，常用于預防和治療豬痢疾、結(jié)腸螺旋體病和地方性肺炎等，同時也被歐盟批準用于防治雞慢性呼吸道病和兔的流行性腸炎[1]。研究表明，沃尼妙林對革蘭陽性菌、胸膜肺炎放線桿菌、副豬嗜血桿菌、支原體和螺旋體等具有良好的抗菌作用[2-3]。藥物血漿蛋白結(jié)合率是指藥物與血漿蛋白結(jié)合的百分數(shù)，是藥代動力學的重要參數(shù)之一，其通過影響藥物在體內(nèi)的分布、代謝與排泄過程，從而影響藥物藥理作用的發(fā)揮，尤其對藥物的臨床應用具有重要的指導意義[4]。本試驗擬采用超濾法結(jié)合HPLC-MS/MS法對沃尼妙林的血漿蛋白結(jié)合率進行研究，通過分別測定沃尼妙林與豬、雞、兔三種靶動物血漿的蛋白結(jié)合率，為指導臨床上沃尼妙林的科學合理用藥提供數(shù)據(jù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 鹽酸沃尼妙林原料藥(含量為99.2%，廣東大華農(nóng)動物保健品有限公司)；乙腈(德國Merck公司，色譜純)；甲酸(美國Fluka公司，色譜純)；三氯乙酸(廣州化學試劑廠，分析純)；去離子水(Milli-Q超純水系統(tǒng)，Academic A10型)，其他試劑為分析純。

1.2 儀器 高效液相色譜儀(美國Agilent公司1200型，配備四元泵、脫氣機、自動進樣器、柱溫箱等)；電噴霧-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀(API 4000質(zhì)譜儀，美國AB SCIEX公司)；高速冷凍離心機(美國Thermo Fisher Scientific公司)；超濾離心管(美國Millipore公司，Amicon Ultra-0.5系列，MWCO 10 kDa)，Strata-X-C固相萃取小柱(60mg，3 mL，美國Phenomenex公司)；氮氣濃縮儀(美國Oranomation Associates，Jnc.公司)；電子分析天平(日本島津公司，AUW120D型)；渦旋混合器(美國SCILOGEX公司)；隔熱式培養(yǎng)箱(美國Thermo Fisher Scientific公司)。1.3 溶液的配制 沃尼妙林儲備液：精密稱取53.66 mg鹽酸沃尼妙林于50 mL容量瓶中，去離子水定容得1 g/L的沃尼妙林儲備液。磷酸緩沖液(PBS)：精密稱取磷酸氫二鉀19.03 g，磷酸二氫鉀2.08 g，氯化鈉4.4 g于1 L容量瓶中，去離子水溶解并定容得pH值7.4磷酸緩沖液。

1.4 血漿的采集 新西蘭兔(雌性和雄性各2只，體重1.8 ± 0.17 kg)，購自廣東省醫(yī)學實驗動物中心。耳緣靜脈采血，3 000 r/min離心10 min，分離血漿，置于4 ℃冰箱中冷凍備用?？瞻棕i血漿和雞血漿，購自廣州蕊特生物科技有限公司。

1.5 超濾液前處理方法 取100 μL超濾液，加入400 μL水混勻后進行固相萃取(SPE)處理：2 mL甲醇活化小柱，2%甲酸水平衡，超濾液過柱，依次用2%甲酸水和甲醇淋洗，用2 mL 5%氨甲醇洗脫，洗脫液于45 ℃下氮氣吹干，500 μL 50%乙腈水復溶。

1.6 色譜與質(zhì)譜條件[5]色譜柱：Waters Symmetry C18 (50 mm×2.1 mm，3.5 μm)；流動相：乙腈(A)和0.1%甲酸水(B)，流速0.25 mL/min；梯度洗脫程序如下：0%～0.5 min 15%～95%A，0.5～3.0 min 95%A，3.0～3.5 min 95%～15%A，3.5～9.0 min 15%A；柱溫：35 ℃；進樣量：5 μL。采用多反應監(jiān)測掃描模式；正離子掃描；電噴霧離子源；噴霧電壓4.5 kV，霧化氣壓力55 psi，輔助氣流速40 L/min，氣簾氣壓力20 psi，離子源溫度650 ℃，碰撞室壓力7 psi。監(jiān)測離子對為565.5→263.1，565.5→285.3，其中565.5→263.1為定量離子對。

1.7 測定方法考察

1.7.1 標準曲線的制備 取沃尼妙林儲備液，用50%乙腈水依次稀釋得到0.01，0.02，0.05，0.1，0.2，0.5 μg/mL的系列濃度，進行HPLC-MS/MS測定。以藥物濃度(C)對峰面積(X)進行線性回歸，得到沃尼妙林的標準曲線和相關(guān)系數(shù)(R)。

1.7.2 準確度與精密度 用pH值7.4 PBS分別配制低、中、高3個濃度(0.1，1.0，10 μg /mL)的沃尼妙林標準溶液，按照1.5方法處理后測定相應的藥物濃度?？疾旆椒ǖ娜諆?nèi)和日間精密度(CV)和準確度。每個濃度5個重復，共3個批次，不同批次間隔1 d或者數(shù)天。

1.8 血漿蛋白結(jié)合率測定 用pH值7.4 PBS配制1.0，10，100 μg/mL的沃尼妙林溶液，分別吸取0.5 mL藥液，至4.5 mL豬、雞和兔血漿中，渦旋混勻1 min，37 ℃水浴孵育2 h，取500 μL含藥血漿，置于超濾管置中，于8 000 r/min(4 ℃)，離心20 min，以10%的三氯乙酸檢測無血漿蛋白滲漏后，另取100 μL超濾液，按照1.5方法進行前處理后，進行HPLC-MS/MS分析測定，每種濃度平行5份。

1.9 超濾膜非特異性結(jié)合考察 取含沃尼妙林濃度0.1，1.0，10 μg /mL的PBS稀釋液，置于超濾管上，于離心機中8 000 r/min離心20 min，取超濾液100 μL進行分析測定，計算超濾膜的回收率均大于95%，表明沃尼妙林與超濾膜無特異性吸附。

2 結(jié)果

2.1 測定方法考察 沃尼妙林在本試驗建立的色譜與質(zhì)譜條件下的保留時間為4.82 min (圖1)，峰形好且靈敏度高，未見超濾液中雜質(zhì)干擾，具有較好的專屬性。該方法檢測限為5 ng/mL，定量限為10 ng/mL。將沃尼妙林的峰面積與相應濃度進行線性回歸，得到的標準曲線在10 ng/mL至500 ng/mL的范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)在0.999以上。

圖1 含沃尼妙林的血漿超濾液的總離子流圖

2.2 準確度與精密度 通過測定添加水平為0.1、1、10 μg/mL的3個分析批樣品的濃度，沃尼妙林的回收率為88.5%～96.2%，批內(nèi)與批間變異系數(shù)分別為4.15%～6.36%和3.11%～8.76%(表1)。在高、中、低3個濃度的添加回收試驗，驗證了該方法的可靠性。

表1 沃尼妙林的回收率和變異系數(shù)(CV)

2.3 沃尼妙林的血漿蛋白結(jié)合率 采用高、中、低的藥物添加濃度，對沃尼妙林與3種動物血漿的蛋白結(jié)合率進行測定，結(jié)果表明，沃尼妙林與豬、雞和兔血漿的蛋白結(jié)合率均在80%以上，分別為84.4%±1.07%，87.5%±1.83%和86.6%±1.96%(表2)。此外，試驗數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS軟件進行方差分析，結(jié)果表明，高、中、低不同濃度的沃尼妙林血漿蛋白結(jié)合率之間無顯著性差異(P>0.05)，蛋白結(jié)合呈現(xiàn)非濃度依賴的特性，且藥物在測定濃度范圍內(nèi)未發(fā)現(xiàn)結(jié)合飽和的現(xiàn)象。

表2 沃尼妙林在豬、雞和兔血漿的蛋白結(jié)合率(n=5)

3 討論

血漿蛋白結(jié)合率與藥物在體內(nèi)的分布、代謝和排泄密切相關(guān)。藥物經(jīng)吸收進入循環(huán)后，只有游離部分的藥物，才能隨血液轉(zhuǎn)運到各器官和組織，進行生物轉(zhuǎn)化和排泄。因此，測定藥物的血漿蛋白結(jié)合率對臨床上給藥方案的調(diào)整尤為重要。目前常用的測定藥物血漿蛋白結(jié)合率的方法包括平衡透析法(equilibrium dialysis)和超濾法(ultrafiltration)[5]。平衡透析法可直接測定處于平衡狀態(tài)下的游離藥物濃度，成本較低，但靜置透析達到平衡的時間較長(37 ℃透析平衡通常需要24～48 h)，難以批量處理樣品[6]。而超濾法是以多孔薄膜作為分離介質(zhì)，依靠超濾膜兩側(cè)壓力差使溶劑和小分子的化合物通過薄膜，截留大分子的血漿蛋白，實現(xiàn)血漿中不同分子量物質(zhì)的快速分離[7]。該方法只需1～2 h即可完成樣品的處理，便于快速測定大批量血漿樣品中的游離藥物濃度。因此，本研究采用超濾法測定的豬、雞和兔血漿中沃尼妙林的蛋白結(jié)合率在84.4%～87.5%之間，其結(jié)果與同類藥物瑞他妙林94%的血漿蛋白結(jié)合率接近[8]。

根據(jù)藥效學理論，藥物與血漿蛋白結(jié)合后相當于暫時儲存在體內(nèi)，隨著游離型藥物的不斷代謝和排泄，結(jié)合型藥物被血漿蛋白緩慢釋放，使游離型藥物能夠保持相對穩(wěn)定，對藥物在體內(nèi)持續(xù)發(fā)揮療效起到了重要的調(diào)節(jié)作用[9]。通常來說，蛋白結(jié)合率高意味著較低的有效藥物濃度、緩慢的清除和延長的半衰期。而對于治療指數(shù)低的藥物，高血漿蛋白結(jié)合的藥物在臨床使用時具有一定的安全風險，一旦有影響蛋白結(jié)合率的因素產(chǎn)生，包括病理因素和藥物的不當聯(lián)合使用，均會使游離型藥物迅速增加，從而導致嚴重的毒副作用產(chǎn)生[10]。與大多數(shù)氟喹諾酮類藥物20%～30%的血漿蛋白結(jié)合率相比[11]，沃尼妙林較高的蛋白結(jié)合率(80%以上)，提示治療時應根據(jù)實際臨床療效，監(jiān)測有效藥物濃度的變化情況，以便于及時調(diào)整給藥劑量，避免可能的不良反應。

[1] Karlsson M，Gunnarsson A，F(xiàn)ranklin A.Susceptibility to pleuromutilins inBrachyspira(serpulina)hyodysenteriae[J].Anim Health Res Rev，2001，2(1):59-65.

[2] Heilmann C，Jensen L，Jensen J S，etal.Treatment of resistantMycoplasmainfection in immunocompromised patients with a new pleuromutilin antibiotic [J].J Infect，2001，43(4):234-238.

[3] Hogenauer G.The mode of action of pleuromutilin derivatives.Location and properties of the pleuromutilin binding site on Escherichia coli ribosomes [J].Eur J Biochem，1975，52(1):93-98.

[4] 梁文權(quán).生物藥劑學與藥物動力學[M].3版.北京:人民衛(wèi)生出版社，2007:106.

[5] Wang R，Yuan L G，He L M，etal.Pharmacokinetics and bioavailability of valnemulin in broiler chickens [J].J Vet Pharmacol Ther，2011，34(3):247-251.

[5] 劉睿，謝躍生，潘桂湘，等.藥物血漿蛋白結(jié)合率測定方法的研究進展[J].天津中醫(yī)藥，2007(6):526-528.

[6] Lin Z J，Musiano D，Abbot A，etal.Invitroplasma protein binding determination of flunarizine using equilibrium dialysis and liquid chromatography-tandem mass spectrometry [J].J Pharm Biomed Anal，2005，37(4):757-762.

[7] Schwarzwald C C，Sams R A.Determination of plasma protein binding of diltiazem in horses by ultrafiltration [J].J Vet Pharmacol Ther，2006，29(6):579-580.

[8] DragBank.http://www.drugbank.ca/drugs/DB01256.

[9] Kunin C M，Craig W A，Kornguth M，etal.Influence of binding on the pharmacologic activity of antibiotics[J].Ann N Y Acad Sci，1973，226:214-224.

[10] Merrikin D J，Briant J，Rolinson G.Effect of protein binding on antibiotic activityinvivo[J].J Antimicrob Chemother，1983，11:233-238.

[11] Bergogne-Berezin E.Clinical role of protein binding of quinolones [J].Clin Pharmacokinet，2002，41:741-750.

Determination and Comparison of Plasma Protein Binding Rates of Valnemulin in Pig，Chicken and Rabbit

ZHOU Wen-jie， ZHOU Yu-feng， LI Xiao， HE Jie-shun， LIU Ya-hong， SUN Jian

(Department of Pharmacology and Toxicology，College of Veterinary Medicine，South China Agricultural University，Guangzhou 510642，China)

The plasma protein binding rates of valnemulin was determined using the ultrafiltration method combined with high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS) and compared in various animal species and different drug levels.The results showed that this method was simple，sensitive and selective for the determination of biological sample of valnemulin.The plasma protein binding rates of valnemulin in pig，chicken and rabbit were 84.4 ± 1.07%，87.5 ± 1.83% and 86.6 ± 1.96%，respectively.After spiking with valnemulin concentrations from 0.1 to 10 μg/mL，the protein binding rates showed no significant differences and indicated a character of non-specific concentration independent.

valnemulin; protein binding; ultrafiltration; HPLC-MS/MS

SUN Jian

2016-03-16

長江學者和創(chuàng)新團隊發(fā)展計劃(IRT13063)；2015年華南農(nóng)業(yè)大學大學生創(chuàng)新訓練計劃項目(201510564101)

周文杰(1993-)，男，碩士生，研究方向為獸醫(yī)藥理與毒理學，E-mail：zwjscau@126.com

孫堅，E-mail：jiansun@scau.edu.cn

S859.79

A

0529-6005(2016)12-0096-03