一株新型鴨肝炎病毒的分離與鑒定

陳生雷，李鳳艷，郭華，邊少國，項偉，舒秀偉，苗玉和

(遼寧益康生物股份有限公司，遼寧遼陽 111000)

一株新型鴨肝炎病毒的分離與鑒定

陳生雷，李鳳艷，郭華，邊少國，項偉，舒秀偉，苗玉和

(遼寧益康生物股份有限公司，遼寧遼陽 111000)

從遼寧省某鴨場疑似鴨病毒性肝炎病料中分離到一株病毒，經PCR檢測初步鑒定其為鴨肝炎病毒，命名為YK株，應用易感鴨胚和雛鴨進行傳代及病毒含量測定，E1～E5代鴨胚適應毒病毒含量在106.5～106.9ELD50/0.2 mL之間，E2代鴨肝組織毒病毒含量為106.3LD50/0.1 mL。動物試驗結果表明，YK株鴨胚適應毒E2代對7日齡雛鴨的致死率高達100%。序列測定分析表明，YK株與DHV-A的VP1基因同源性在71.4%～72.3%之間，與DHV-B的VP1基因同源性在71.9%～72.3%之間，與DHV-C的VP1基因同源性在94.3%～98.8%之間。試驗表明，YK株與韓國新型鴨肝炎病毒在同一分支上，屬于基因C型DHV。

鴨肝炎病毒；分離；鑒定

鴨病毒性肝炎(duck viral hepatitis，DVH)是由鴨肝炎病毒(duck hepatitis virus，DHV)引起的一種傳播迅速并高度致死雛鴨的病毒性傳染病，以發病急、傳播快、病程短、死亡率高為主要特征，主要侵害4周齡以內雛鴨，1周內最易感，死亡率可高達90%以上[1-2]。研究表明，鴨肝炎病毒有三個血清型，即Ⅰ型(DHV-1)及其變異株(la型)、Ⅱ型(DHV-2)和Ⅲ型(DHV-3)，DHV-2和DHV-3又分別被稱為臺灣新型和韓國新型，三個血清型之間沒有交叉保護和交叉中和作用。

為了更好地研究鴨病毒性肝炎的病原，根據DHV的基因進化規律又將其分為A、B、C型，分別對應原有的DHV-1、臺灣新型、韓國新型[3-5]。新型的鴨肝炎病毒的出現給養鴨業帶來了嚴重的經濟損失。近年來，戴玉婷[6]、孫林杰[7]、張雪[8]等相繼報道了與DHV-1不同的新型鴨肝炎病毒。本試驗對遼寧省疑似鴨病毒性肝炎病鴨進行了病原分離和鑒定，以期為鴨病毒性肝炎的防治提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料 DHV-1型病毒SDE株及其陽性血清，由遼寧益康生物股份有限公司提供；疑似DHV病料來自遼寧省一鴨場的發病鴨。

1.2 實驗動物 易感鴨胚及健康易感雛鴨，由遼寧益康生物股份有限公司提供，使用前檢測抗體為陰性。

1.3 試劑 核酸提取試劑盒和RT-PCR一步法試劑盒，購自北京全式金生物科技有限公司。

1.4 病毒鑒定與增殖

1.4.1 RT-PCR初步鑒定 根據GenBank中已公布的新型鴨肝炎病毒全基因序列，設計引物，上游引物：5’-AGCACGAGAGACCCTTACG-3’，下游引物：5’-CCCACAGGCTCTCACTAAAG-3’，由寶生物工程(大連)有限公司合成。將采集的病料處理后，應用上述特異性引物按程序進行RT-PCR擴增，產物于1%瓊脂糖凝膠電泳后觀察，預計擴增片段長度為770 bp。

1.4.2 在鴨胚上增殖 將無菌采集的病鴨肝臟在滅菌的研磨器內充分研磨，用滅菌生理鹽水制成l︰5乳劑，3000 r/min 離心30 min，取上清液，加青、鏈霉素，使終濃度為2000 IU/mL，4 ℃過夜。取11日齡易感鴨胚20枚，分為2組，第1組為試驗組，經尿囊腔途徑接種病料，0.2 mL/胚；第2組為對照組，經尿囊腔途徑接種滅菌生理鹽水，0.2 mL/胚。接種后繼續孵化，每日照蛋2次，收獲24～144 h死亡胚尿囊液，觀察胚體及內臟病變，參照《中國獸藥典》[9]經無菌、支原體及外源病毒檢測合格后凍干保存、備用。按此方法連續傳代。

1.4.3 在易感雛鴨上增殖 將1.4.2樣品做100倍稀釋后，經胸部肌肉注射7日齡雛鴨，0.1 mL/只。觀察7日，無菌采集攻毒后死亡且具有典型病變的鴨肝臟，研磨后分裝，-20 ℃保存。

1.4.4 對鴨胚的半數致死量測定 取分離株鴨胚尿囊液作10倍系列稀釋，取適宜稀釋度經尿囊腔接種11日齡易感鴨胚，每個稀釋度接種5枚，0.2 mL/枚，37 ℃孵育，觀察7日，記錄鴨胚死亡情況，按Reed-Muench 法計算鴨胚半數致死量(ELD50)[9]。

1.4.5 對易感雛鴨的半數致死量 將肝組織毒E2經10倍系列稀釋，取適宜稀釋度經胸部肌肉注射7日齡易感雛鴨，每個稀釋度接種6只，0.1 mL/只，觀察10日，計算雛鴨半數致死量(LD50)[9]。

1.4.6 動物致病性試驗 取7日齡雛鴨20只，隨機分為2組，第1組將收獲的E2代鴨胚尿囊液作10倍稀釋，經胸部肌肉接種雛鴨10只，0.2 mL/只；第2組將0.85%滅菌生理鹽水經胸部肌肉接種雛鴨10只，0.2 mL/只，作為對照組。觀察10日，記錄發病死亡情況，死亡鴨解剖觀察病理變化。

1.4.7 特異性血清中和試驗 采用固定病毒稀釋血清法進行測定，將鴨胚適應毒E2代和SDE株E2代病毒液稀釋至病毒含量為200 ELD50/0.1 mL，取適宜稀釋度SDE株陽性血清與等量的200 ELD50病毒液混合，37 ℃中和1 h，0.2 mL/枚，同時設立血清對照和病毒對照組，5枚/組，37 ℃孵育7日，記錄各組死亡情況。1.4.8 基因序列測定與分析 將PCR產物送至寶生物工程(大連)有限公司進行測序，并將結果用DNAStar軟件進行序列分析，參考序列見表1。

表1 參考序列

2 結果

2.1 分離鑒定結果 將臨床疑似鴨肝炎病例的感染動物，采集肝組織，經研磨處理經RT-PCR初步鑒定為新型鴨肝炎病毒(圖1)，此病毒能在鴨胚上增殖，并能使7日齡易感雛鴨發病。

M：DL2000 Marker；1：YK株鴨胚毒；2：YK株肝組織毒；3：SDE株；4：陰性對照圖1 RT-PCR結果

2.2 鴨胚傳代及病毒含量測定 在11日齡鴨胚上連續傳代至E5代，接種鴨胚后死亡時間主要集中在96～120 h，死亡胚皮下出血、水腫，肝臟有明顯的壞死灶或壞死點(圖2)，對照組鴨胚則全部存活。傳至E3代后鴨胚死亡規律，毒價穩定，表明該分離株能很好的適應11日齡易感鴨胚。結果見表2。

表2 鴨胚傳代死亡比例及病毒測定結果

2.3 雛鴨半數致死量測定 將YK株E2代肝組織毒應用7日齡易感雛鴨進行半數致死量測定，易感雛鴨于攻毒后24 h開始死亡，死亡高峰集中在24～48 h，死亡雛鴨呈現典型的角弓反張狀態，剖檢肝臟有明顯的點狀出血。結果YK株E2代肝組織毒對雛鴨的半數致死量為106.3LD50/0.1mL。2.4 動物致病性試驗 第1組試驗鴨攻毒后24 h開始發病死亡，72 h全部死亡，死亡主要集中在攻毒后24～48 h，共死亡20只，致死率高達100%；臨床癥狀為突然發病，精神萎靡，食欲廢絕，發病片刻即倒地，先是兩腿向上作游泳樣劃動，后頭部向后仰，呈現角弓反張狀。解剖死亡鴨，肝臟腫脹，呈土黃色，有明顯的出血斑點，其他臟器無顯著變化，剖檢結果見圖3。第3組對照鴨則全部健康存活。

2.5 血清中和試驗 表3結果表明，YK株不能被Ⅰ型鴨肝炎病毒陽性血清中和，SDE株能被Ⅰ型鴨肝炎病毒陽性血清中和，說明YK株和SDE株為不同血清型。

圖2 YK株接種后鴨胚及肝臟病變

圖3 攻毒后死亡雛鴨及病變肝臟

毒株鴨胚死亡比例DHV-1陽性血清病毒對照空白對照YK株5/55/50/5DHV-1型SDE株0/55/5/

2.6 測序分析 應用設計引物，對YK株進行RT-PCR擴增并將產物進行測序，將測序結果與鴨肝炎病毒VP1基因序列進行比對，并構建進化樹。結果顯示，YK株與DHV-C型基因同源性為94.3%～99.0%，與臺灣新型(04G和90D)基因同源性分別為71.9%和72.3%，該分離株與DHV-C型屬于同一基因型，且與DHV-B型相鄰，但與DHV-A處于不同的分支。結果見圖4、圖5。

圖4 YK株測序結果進化分析

圖5 不同毒株基因序列比較分析

3 討論與小結

本試驗應用RT-PCR檢測，對遼寧省某地發病鴨初步鑒定為新型鴨肝炎病毒，并使用易感鴨胚對病料進行分離傳代培養，該分離株經病毒含量測定、半數鴨胚致死量測定、本動物回歸試驗、血清中和試驗鑒定為為DHV-C型鴨肝炎病毒，并命名為YK株。

目前鴨病毒性肝炎的預防與治療主要以Ⅰ型的弱毒疫苗和卵黃抗體制劑為主，但Ⅰ型和新型的鴨肝炎病毒之間不具備交叉保護。本研究中成功分離到DHV-C型鴨肝炎病毒，為進一步研制針對DHV-C型鴨肝炎病毒的抗體制劑或疫苗奠定了基礎。

[1] 陸承平. 獸醫微生物學[M]. 3版. 北京: 中國農業出版社，2001.

[2] 劉美玲. 鴨病毒性肝炎的流行病學特征及防制[J]. 中國畜牧獸醫， 2008，35(7)： 103-104.

[3] Kim M C，Kwon Y K，Joh S J，etal． Recent Korean isolates of duck hepatitis virus revealed the presence of a newgeno-and serotype when compared to duck hepatitis virus type 1 type strain[J]. Arch Virol， 2007，152 (11) ： 2059-2072．

[4] Wang L，Pan M，Fu Y，etal． Classification of duck hepatitis virus into three genotypes based on molecular evolutionary analysis[J]. Virus Genes，2008，37(1) ：52-59．

[5] 韋天超，石夢霞，蘭奉瑜，等. 一株廣西新型鴨肝炎病毒的分離與初步鑒定[J].廣西畜牧獸醫，2012，28(5):259-260.

[6] 戴玉婷,王杉，宋揚，等. 鴨甲肝病毒VP1基因克隆及序列分析[J]. 中國獸藥雜志，2015，49(2)：18-21.

[7] 孫林杰，王雪平，宋國亮，等.一株鴨肝炎病毒的分離與鑒定[J].中國獸藥雜志，2014，48(4)：15-18.

[8] 張雪，龔文孝，胡勇，等.Ⅰ型鴨肝炎病毒基因C型株的分離與鑒定[J]. 動物醫學進展，2015，36(1)：23-26.

[9] 中國獸藥典委員會. 中和人民共和國獸藥典[S]. 2010版. 北京：中國農業出版社，2011.

(編輯：李文平)

Isolation and Identification of a Duck Hepatitis Virus Strain

CHEN Sheng-lei, LI Feng-yan, GUO Hua, BIAN Shao-guo,XIANG Wei, SHU Xiu-wei, MIAO Yu-he

(LiaoningYikangBiologicalCo.,Ltd,Liaoyang,Liaoning111000,China)

A virus strain was isolated from suspected duck viral disease from dead duck in liaoning Province,and identified by reverse-transcriptase polymerase chain reaction.It is a duck hepatitis virus that named YK strain.The isolates were passed from E1to E5,the titer determination in duck embryos were from 106.5to 106.9ELD50/0.2 mL; the titer determination in duckling hepatitis tissue titer was 106.3/0.1mL at E2. Animal regression experimental results showed that The YK strain in duck embryos to 7- day- old duckling mortality was 100%.Sequence comparison with DHV-A serotype showed that the identity was 71.4%～72.3%, 71.9%～72.3% with DHV-B serotype and 94.3%～98.8% with DHV-C serotype.It proves that the YK strain and new serotype strain in Korea belongs to DHV-C serotype.

duck hepatitis virus；isolation；identification

陳生雷，獸醫師，從事生物制品研究工作。E-mail: chenshenglei1028@163.com

2015-09-18

A

1002-1280 (2016) 01-0019-05

S852.65