肥豬散發酵制劑的制備方法及質量評價

郭芳茹，張遂平，楊慧敏，苑青艷

(河南亞衛動物藥業有限公司，鄭州 450008)

肥豬散發酵制劑的制備方法及質量評價

郭芳茹，張遂平，楊慧敏，苑青艷

(河南亞衛動物藥業有限公司，鄭州 450008)

為了對肥豬散進行發酵和質量評價，采用固態發酵法，以各活性成分的含量為指標對其進行處方篩選及優化工藝，從性狀、粒度、活菌數、游離大豆異黃酮的含量及穩定性等方面評價其質量。結果表明：最適宜的發酵菌株為納豆芽孢桿菌，發酵溫度為38 ℃，發酵時間為4 d，接菌量為12%，含水量為140%，干燥溫度為47 ℃。肥豬散發酵制劑性質穩定，游離大豆異黃酮的含量為99.36 μg/g。采用固態發酵法制備的發酵肥豬散活性物質含量高，穩定性好。

肥豬散；固態發酵；工藝優化；質量評價；活菌數

肥豬散由綿馬貫眾、制何首烏、麥芽和炒黃豆組成，具有開胃、驅蟲、補養和催肥的作用，能夠提高畜禽的消化吸收機能和飼料利用率[2]。肥豬散傳統使用方法是將中藥粉碎后直接拌料飼喂，操作簡單，但由于藥物粒度較大，其中又存在很多難以溶出的活性成分，造成藥物的利用率低，藥效不能得到充分發揮。

中藥發酵技術是在一定的溫度和濕度條件下，利用酶和微生物的分解催化作用，將藥物發泡、生衣的方法。該方法結合了傳統發酵炮制工藝和現代生物技術、微生態學的優勢，可以提高中藥有效成分的提取率、增強藥效、產生新的活性物質、減輕藥物的毒副作用，為中藥的應用開辟新的途徑。文獻報道[1]，黃芪發酵后所含的黃芪多糖是普通煎、煮、熬水提方法的0.365～5.040倍，我國衛生部藥品檢驗所動物試驗結果顯示，發酵中草藥只需1/28的量，即可與一般煎、煮、熬水提物一份的量發揮同等的藥效。

試驗將中藥發酵技術應用到肥豬散中，利用現代生物技術和傳統中藥炮制方法結合，采用微生物發酵的方式對中藥散劑進行科學處理，降低藥物的毒副作用，以期彌補中藥散劑起效慢和生物利用度低的缺陷。

1 材料

1.1 儀器 依利特P230高效液相色譜儀，HS3120型超聲波清洗機，YXQL31400型立式電熱壓力蒸汽消毒器，HHB11420型電熱恒溫培養箱，SWCJ1F型凈化工作臺，XS-18型顯微鏡，南京勝光醫療器械廠產品。

1.2 試劑與藥品 黃豆(市售)，麥芽(鄭州龍海啤酒物資有限公司)，綿馬貫眾(湖南省龍山縣春燕中藥材種植專業合作社)，何首烏(安徽曙光藥業銷售有限公司)，大豆苷元對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號111602-200901)，染料木素對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號111802-201001)，MRS培養基(上海源葉生物科技有限公司)、麥芽汁培養基(自制)、牛肉膏蛋白胨培養基(北京雙旋微生物培養基制品廠)、PDA培養基(自制)，瓊脂粉(北京索萊寶科技有限公司)，乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純。

1.3 菌株 保加利亞乳桿菌(Lactobacillusbulgaricus，廣東省微生物研究所，編號：GIM1.204)、啤酒酵母菌(Saccharomycescerevisiae，中科院微生物菌種保藏中心，編號：ATCC9763)、納豆芽孢桿菌(Bacillusnatto，河南農大微生物實驗室提供，編號：ATCC6633)、米曲霉(Aspergillusoryzae，上海通派生物科技有限公司，編號：CGMCC3.336)。

2 方法與結果

2.1 單因素試驗 設計單因素試驗，考察發酵菌種類、發酵時間、發酵溫度、接菌量和干燥溫度對游離大豆異黃酮含量的影響，試驗內容及結果見表10所示。

表1 單因素試驗結果

游離大豆異黃酮的測定采用高效液相色譜法[3]，色譜柱Diamonsil-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)，流動相為乙腈-0.2%磷酸(36∶64)，流速為1.0 mL/min，柱溫30℃，檢測波長260 nm，進樣量為20 μL。

對照品溶液的制備：精密稱取染料木素和大豆苷元對照品各25 mg，分別用無水乙醇定容至25 mL作為儲備液，精密吸取兩種儲備液各1 mL置于同一100 mL容量瓶中，無水乙醇定容至刻度作為對照品溶液，其中含兩種對照品的濃度均為10 μg/mL。

供試品溶液的制備：取肥豬散發酵制劑1 g，精密稱定，置錐形瓶中，加入70%乙醇25 mL，超聲處理30 min，用70%乙醇補足減失的重量，搖勻過濾，取續濾液經0.45 μm微孔濾膜過濾即得供試品溶液。

2.2 多因素試驗優化處方和工藝 采用三因素三水平正交試驗的方法對發酵時間、接種量、發酵溫度進行優化，按照正交試驗表制備出發酵肥豬散樣品。

肥豬散發酵制劑的制備工藝為：取綿馬貫眾30 g，何首烏30 g，麥芽500 g，炒黃豆500 g，混合后粉碎過5號篩，得到淺黃色粉末。稱取10 g平鋪于90 mm平皿中，厚度約為3 mm，蓋好后正置，121℃高壓滅菌30 min，即得發酵培養基；配制牛肉膏蛋白胨培養基，分裝滅菌后，挑取斜面菌種接種于液體培養基，于120 r/min，37℃條件下振蕩培養18 h[4]，加入適量的無菌水稀釋得到發酵用菌懸液，將菌懸液與發酵培養基均勻混合，置于適宜的溫度下發酵一定時間后取出，烘干，粉碎過篩得到顏色較深、氣味濃郁的肥豬散發酵制劑成品。

利用樣品中活菌數、游離大豆異黃酮、結合蒽醌[5]、麥芽堿[6]以及綿馬素[7]的含量5個綜合指標篩選出最佳的處方和工藝，設置分值分別為30、30、15、15、10。正交試驗及各指標的測定結果和結果分析見表2所示。

由正交試驗分析結果得出，接種量對工藝的影響較大，其次是培養時間，溫度的影響較小，通過綜合評分和直觀分析，得出A3B3C2為最佳制備工藝。即：發酵菌種為納豆芽孢桿菌，加水量為140%，接菌量12%，發酵溫度38℃，發酵時間為4 d，干燥溫度為47℃。制備出的肥豬散發酵制劑性狀為深棕褐色粉末，有濃郁的醬香味。

表2 正交試驗結果

2.3 基本性質及含量測定 按照最佳制備工藝制備出三批樣品，參照參考文獻[2]，測定以下檢測指標。結果見表3所示。

2.3.1 性狀 取適量肥豬散發酵制劑，置光滑紙上，平鋪約5 cm2，將其表面壓平，在明亮處觀察，為色澤均勻的深棕褐色粉末。

2.3.2 粒度 采用篩分法，測定方法為：稱取100 g樣品，置5號藥典篩內，通過5號篩的樣品平均為96.3%。

2.3.3 水分 水分平均含量為3.8%。

2.3.4 游離大豆異黃酮的含量 采用高效液相色譜法，三批發酵肥豬散中游離大豆異黃酮的平均含量為99.36 μg/g，RSD為2.1。2.3.5 活菌數 按平板菌落計數法對制劑中活菌數進行檢測，以每個平板上生長30～300個菌落為宜，試驗重復三次，取平均值，計算肥豬散發酵制劑中含有的活菌數為3.34×1010CFU/g。

表3 肥豬散發酵制劑質量評價結果

2.4 加速試驗

將三批肥豬散發酵制劑粉末置于培養皿中，攤成厚度小于5 mm的薄層，置于藥物穩定性試驗箱中，在溫度為40 ℃±2 ℃，RH為75%±5%的條件下放置6個月，試驗期間第1個月、2個月、3個月、6個月末分別取樣一次，對肥豬散發酵制劑的外觀、游離大豆異黃酮的含量和活菌數進行考察，與0天結果比較。三批肥豬散發酵制劑的外觀性狀均為棕褐色粉末，其它數據見表4。

采用單因素試驗和正交試驗確定的處方和工藝條件制備出3批肥豬散發酵制劑樣品，并對游離大豆異黃酮的含量、活菌數及制劑穩定性進行了考察，含量結果分別為97.15%、101.25%、99.67%，在加速條件下放置6個月，含量無明顯變化，說明該工藝穩定可靠，適用于制備肥豬散發酵制劑。

表4 肥豬散發酵制劑加速試驗穩定性

3 討論與小結

影響散劑發酵結果的因素很多，本試驗先采用單因素試驗的方法對制備發酵菌種、發酵時間、發酵溫度、接種量等因素進行了考察，再采用正交試驗的方法對處方和工藝進行優化，得出制備肥豬散發酵制劑理想的工藝條件。

肥豬散中含有4種中藥，每種中藥的活性成分在發酵時都會發生變化，因此，本試驗先以含量最高的游離大豆異黃酮為指標進行單因素試驗，確定發酵工藝的主要影響因素及其大致范圍，再綜合考慮各活性成分的含量變化，確定制備的最佳處方和工藝。陳富文等[8]采用響應面法優化復方中藥的發酵工藝，以高效液相色譜圖中總峰面積的提高率為指標確定最佳發酵工藝，為復方中藥發酵工藝開發提供了基礎和參考，但本試驗中的結合蒽醌類物質是以其含量的下降為判斷指標，因此不適合采用總峰面積法。

本試驗制備的肥豬散發酵制劑活菌數含量高，游離大豆異黃酮的含量比發酵前提高1倍，何首烏中致下泄作用的蒽醌類物質的含量顯著降低，說明微生物發酵過程能夠提高藥物活性物質的含量，降低毒性[9]，這與張炳文[10]和杜晨暉等[11]研究的結果是一致的。 有關資料顯示麥芽經發酵炮制后，可產生新的活性物質，能夠抑制動物的支原體感染[12]，這種新活性物質的成分和結構有待于進一步研究。

肥豬散發酵制劑的質量評價結果符合藥典對中藥散劑的要求，在加速條件下放置6個月，外觀無明顯變化，含量無明顯下降現象，活菌數先下降后保持穩定，說明該發酵制品穩定性較好，可以在室溫下存放。

發酵中藥中還含有大量的活性益生菌，其本身就具有調節胃腸道菌群平衡，助消化和促生長的作用，因此發酵中藥在我國畜牧生產上發揮“量少、高效、安全”的優勢，對我國發展無公害畜牧業，生產綠色畜產品，增強我國畜產品在國際上的競爭力具有重要作用[13]。最近幾年，發酵技術在飼料上應用很多，但在獸用中藥散劑中應用并不常見[14]。隨著現代制藥技術的發展，發酵技術將會成為中藥現代化的重要手段。

[1] 張高娜，張建梅，谷巍. 微生物發酵中草藥在動物生產中的應用[J]. 廣東飼料，2012，21(10)：28-31.

[2] 中國獸藥典委員會. 中華人民共和國獸藥典(2010)[S].

[3] 張敏，王鵬嬌，舒陽，等. 貴州豆豉發酵前后大豆異黃酮含量測定. 貴陽醫學院學報[J]，2011,36(4)：359-361.

[4] 帥明，黃占旺，牛麗亞. 納豆芽孢桿菌的固態發酵條件[J]. 食品與生物技術學報，2009,28(1)：122-126.

[5] 施群，施淑琴. 炮制對何首烏總蒽醌含量的變化研究[J]. 中華中醫藥學刊，2012,30(12)：2770-2772.

[6] 王曉榮，李菊平，孫緒丁. HPLC法測定唐古特烏頭中大麥芽堿的含量[J]. 實用醫藥雜志，2013,30(7)：624-625.

[7] 司云珊，徐暾海，韓冬，等. RP-HPLC法測定綿馬貫眾藥材中綿馬貫眾素[J]. 中草藥，2008,39(12)：1894-1895.

[8] 陳富文，史高峰，王國英，等. 響應面法優化復方中藥發酵工藝[J]，中國中醫藥信息雜志，2014，21(4)：73-77.

[9] 高慧娟，鄭林用，余夢瑤，等. 微生物技術在中藥開發中的應用[J]，時珍國醫國藥，2011，22(3)：728-730.

[10]張炳文,宋永生,郝征紅,等. 發酵處理對大豆制品中異黃酮含量與組分的影響[J] .食品與發酵工業. 2002(7)：6-9.

[11]杜晨暉，王興紅，趙榮華，等. 發酵法炮制何首烏的初步研究[J]. 天然產物研究與開發，2008(3)：540-544.

[12]梅特·希德弗吉. 發酵的麥芽在飼養和獸醫實踐中的用途. 匈牙利，02829451.3[P]. 2005-08-03.

[13]張高娜，張建梅，谷巍. 微生物發酵中草藥在動物生產中的應用[J].廣東飼料，2012，21(10)：28-31.

[14]張秀云. 微生物發酵在中藥研究中的應用[J]. 北方藥學，2012，9(4)：110.

(編輯：陳希)

Preparation and Quality Evaluation of Fermented Feizhusan

GUO Fang-ru，ZHANG Sui-ping，YANG Hui-min，YUAN Qing-yan

(HenanYaweiVeterinaryPharmaceutcalCo.,LTD,Zhengzhou450008；China)

To prepare fermented Feizhusan and to evaluate the quality of the product. Fermented Feizhusan was prepared by solid fermentation, suitable prescription was screened out by single factor tests and orthogonal test was performed to optimize the technological conditions. The quality of fermented Feizhusan was evaluated in properties, granularity, viable count, content of active ingredients and stability. Results revealed that the optimal fermentation strain wasbacillusnattoand temperature was 38 ℃, time was 4 d, quantity of bacteria was 12%, water content was 140% and drying temperature was 47 ℃. The basic properties was stability, the content of soybean isoflavones aglycon was 99.36 μg/g. Solid fermentation can be used to prepare fermented Feizhusan which contains high quantities of active ingredients and stable character.

Feizhusan；solid fermentation；technology optimization；quality evaluation；viable count

郭芳茹，碩士。從事獸藥新產品和新劑型研發。E-mail : 460294979@qq.com

2015-09-08

A

1002-1280 (2016) 01-0066-04

S852.65