PRRSV體外感染PAMs對IFN-γ mRNA轉錄水平的影響

閆曉霞，劉歡歡，曾夢穎，高洪，嚴玉霖

(云南農業大學動物科學技術學院，昆明 650201)

PRRSV體外感染PAMs對IFN-γ mRNA轉錄水平的影響

閆曉霞，劉歡歡，曾夢穎，高洪，嚴玉霖*

(云南農業大學動物科學技術學院，昆明 650201)

為探討豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)體外感染豬肺泡巨噬細胞(PAMs)對IFN-γ mRNA轉錄水平的影響,選用PRRSV血清抗體和抗原均為陰性的4周齡健康仔豬3頭，無菌分離PAMs，隨機將其分為對照組、PRRSV感染組(PRRSV組)、PRRSV+PHA組和RRRSV+Dex組，分別在培養6、12、24、48和60 h收集PAMs。運用熒光定量PCR檢測IFN-γ和PRRSV mRNA轉錄情況。結果顯示，PRRSV mRNA轉錄量在感染PAMs后6～24 h逐漸升高，在48 h有所下調，在60 h再次升高，IFN-γ mRNA轉錄量在6～48 h逐漸升高，24、48 h顯著高于對照組，而到60 h又恢復到對照組水平；與同時間點的PRRSV組相比，PRRSV+PHA組中PRRSV mRNA轉錄量有所下調，IFN-γ mRNA轉錄量有所上調；而RRRSV+Dex組PRRSV mRNA轉錄量有所上調，IFN-γ mRNA轉錄量所下調。結果表明，IFN-γ 在一定程度上可以抑制PRRSV在PAMs中的增殖，IFN-γ的抑制可能是PRRSV導致細胞損傷的機制之一。

豬繁殖與呼吸綜合征病毒；肺泡巨噬細胞；干擾素-γ

豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)屬于動脈炎病毒科動脈炎病毒屬，是一種有囊膜的不分節段的單股正鏈RNA病毒[1-2]。根據基因組及致病性的差異，PRRSV可分為2個型，即歐洲型(LV株為代表株)和美洲型(ATCC-VR2332株為代表株)[3]。PRRSV主要侵害肺泡巨噬細胞(Pulmonary alveolar macrophage，PAMs)，從而導致彌散性間質性肺炎，損害機體免疫機能，進一步對機體造成繼發性感染[4]，給世界的養豬業帶來了巨大的經濟損失[5]。干擾素(interferon，IFN)是一類具有廣譜抗病毒、抗腫瘤和增強免疫功能的細胞因子,主要由活化的T 細胞、NK 細胞和巨噬細胞產生，可誘導細胞產生多種抗病毒蛋白，促進抗病毒免疫[6-7]。 國內外對PRRSV感染PAMs的研究主要局限在I型干擾素。鑒于此，本研究運用實時熒光定量PCR技術，對PRRSV 感染PAMs不同時期IFN-γmRNA轉錄水平的變化進行檢測，從而了解IFN-γ與PRRSV 抗感染之間的關系，為PRRSV的防控提供參考依據和技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒 PRRSV云南株YN-2011(登錄號：JX857698)由本實驗室分離純化保存，其TCID50為1 mL 105.06。

1.1.2 實驗動物 經ELISA 和RT-PCR方法檢測PRRSV血清抗體和抗原均為陰性的4周齡健康仔豬3頭。

1.1.3 主要儀器與試劑 XDS-2倒置顯微鏡購自重慶光電儀器總公司；CO2培養箱購自美國Thermo scientific公司；BIO-RAD-CFX熒光定量PCR儀購自美國BIO-RAD公司。RPMI-1640培養基、胎牛血清購自美國Hyclone公司；PRRSV抗體ELISA檢測試劑盒購自北京愛德士元亨生物科技有限公司；PHA-L購自美國Sigma公司；Trizol試劑購自美國Invitrogen公司；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA eraser、SYBR Premix Ex TaqTM (Tli RNaseH Plus)購自寶生物工程( 大連) 有限公司。

1.2 方法

1.2.1 肺泡巨噬細胞的制備 將試驗豬置于無菌室解剖臺上，頸靜脈放血致死，剖開胸腔，結扎氣管后連同心臟取出完整的肺，用0.01 g/L pH 7.4的PBS充分漂洗肺表面，清除血塊，從氣管往肺注入0.01 g/L pH 7.4的PBS 50～100 mL,輕輕拍打肺表面1～2 min后回收灌洗液，用單層無菌過濾篩過濾，收集全部灌洗液，1500 r/min離心5 min，最后用含有雙抗的 PBS洗滌PAMs兩次，1500 r/min離心5 min，即為所得PAM。RPMI-1640培養基重懸細胞并計數，調整細胞濃度為2×106mL-1，以每孔2 mL鋪在6孔細胞板于37 ℃、 5% CO2培養箱培養2 h，當PAMs貼壁后，棄上清,待用。

1.2.2 試驗分組與處理 將生長在6 孔板上的PAMs 細胞分為4 組。正常對照組；PRRSV感染組；PRRSV+PHA組：在經過PRRSV感染后的PAMs中加入5 μg/mL的PHA-L進行處理[8]；RRRSV+Dex組：在經過PRRSV感染后的PAMs中加入0.1 mg/mL的Dex進行處理[9]。每組設3個重復。各組加入的病毒量為100 μL，對照組接種等體積的細胞培養液，分別于感染后6、12、24、48和60 h收集PAMs，-80 ℃保存，用于熒光定量PCR檢測。

1.2.3 熒光定量PCR檢測PRRSV和IFN-γ mRNA轉錄水平 使用Trizol提取總RNA，應用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA eraser試劑盒逆轉錄總RNA成為cDNA，于-20 ℃保存。Realtime-PCR反應體系: SYBR Premix Ex TaqII(Tli RNaseH Plus)12.5 μL， 上、下游引物(表1)各1.0 μL，cDNA 2 μL，dH20 8.5 μL。按以下程序進行Realtime-PCR反應：95 ℃預變性30 s；95 ℃ 5 s，Tm 30 s；72 ℃ 30 s，共40個循環。每個樣本設置3個重復孔。

表1 實時熒光定量PCR引物

1.2.4 IFN-γ與PRRSV mRNA轉錄水平相關性分析 根據各試驗組各時間點IFN-γ與PRRSV mRNA相對轉錄量，以PRRSV mRNA轉錄水平為縱坐標，IFN-γ mRNA轉錄水平為橫坐標，做轉錄水平相關性分析。

2 結果與分析

2.1 細胞中IFN-γ mRNA轉錄 根據不同時間點Ct值，用2-△△Ct計算不同組IFN-γ mRNA相對轉錄量。IFN-γ mRNA在各組不同時間點的轉錄水平如圖1。PRRSV組中，IFN-γ mRNA轉錄量在6～48 h逐漸升高，6 h顯著低于對照組(P<0.01)，24和48 h顯著高于對照組(P<0.01)，而到60 h又恢復到對照組水平；PRRSV+PHA組IFN-γ mRNA轉錄水平顯著高于對照組及PRRSV組；RRRSV+Dex組IFN-γ mRNA轉錄水平在6、12、24和60 h顯著低于對照組和PRRSV組(P<0.01或P<0.05)。

圖1 IFN-γ mRNA在各組不同時間點的轉錄水平(*P<0.05，**P<0.01)

圖2 PRRSV mRNA在各組不同時間點的轉錄水平(*P<0.05，**P<0.01)

2.2 細胞中PRRSV mRNA轉錄 根據不同時間點Ct值，用2-△△Ct計算不同組PRRSV mRNA相對轉錄量。由圖2可以看出，PRRSV組PRRSV mRNA轉錄量在感染后6～24 h逐漸升高，48 h有所下調，60 h再次升高；PRRSV+PHA組PRRSV mRNA的轉錄量與相同時間點PRRSV組中PRRSV mRNA的轉錄量相比顯著下調(P<0.01或P<0.05)；RRRSV+Dex組PRRSV mRNA的轉錄量與相同時間點PRRSV感染組相比有所上調，在12、24 h差異顯著(P<0.01或P<0.05)。

2.3 IFN-γ與PRRSV mRNA轉錄水平相關性分析 不同試驗組之間IFN-γ與PRRSV mRNA相關性分析見圖3。根據|R|∈[0.1,0.3)為弱相關，|R|∈[0.3,0.5)為中等相關，|R|∈[0.5,1.0]為強相關得出：PRRSV感染組R2=0.01728，R=0.13，弱相關；PRRSV+PHA組R2=0.0176，R=0.13，弱相關；RRRSV+Dex組R2=0.086，R=0.29，弱相關。

圖3 不同實驗組 IFN-γ與PRRSV轉錄水平相關性分析

3 討論與小結

IFN-γ主要是由抗原、有絲分裂素等刺激、活化的CD4+Th1、CD8+T細胞及NK細胞所分泌的一類可溶性糖蛋白，有較強的抗病毒活性和免疫調節作用，如誘導單核細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞、星狀細胞等MHCⅡ類抗原的表達，使其參與抗原遞呈和特異性免疫的識別過程，促進巨噬細胞 FcγR 表達，協同誘導腫瘤壞死因子(tumor necrosis factors, TNF )并促進巨噬細胞殺傷病原微生物[10]。抗原、T細胞促分裂素(PHA)、細胞因子(IL-2、IL-12、IL-18)會誘導IFN-γ的合成，地塞米松、糖皮質激素、IL-10對INF-γ的產生具有抑制作用[11]。因此選取PHA作為陽性對照，地塞米松作為陰性對照。本研究應用q-PCR技術對不同組中IFN-γ的mRNA轉錄水平進行分析，結果發現PRRSV組中，IFN-γ mRNA轉錄量在6～48 h逐漸升高，說明PRRSV可以刺激PAMs分泌IFN-γ。而6 、12 h低于對照組，說明該時期可能處于病毒感染的初期，刺激PAMs分泌IFN-γ的能力較弱，而到了60 h又恢復到對照組水平是因為病毒在PAMs中的增殖，大量的PAMs已脫落、凋亡。以上結果與夏九鮮等人的研究結果相類似[12]。而PRRSV+PHA組和RRRSV+Dex組IFN-γ mRNA轉錄水平分別高于和低于同時間點的PRRSV組，這一結果與T細胞促分裂素(PHA)會誘導IFN-γ的合成，地塞米松對INF-γ的產生具有抑制作用的研究相符[11]。

已有研究表明IFN-γ可以抑制PRRSV 在體外培養的細胞中增殖。本研究應用q-PCR技術對不同組中PRRSV的mRNA轉錄水平進行檢測，結果發現PRRSV+PHA組PRRSV mRNA的轉錄量與相同時間點PRRSV組中PRRSV mRNA的轉錄量相比顯著下調，這一結果與利用IL-12處理PAMs刺激其分泌IFN-γ最終可以降低PRRSV在PAMs中的增殖的結果相類似[8]。RRRSV+Dex組PRRSV mRNA的轉錄量與相同時間點PRRSV感染組相比有所上調，這與佟杰[13]等研究地塞米松可以加強PRRSV在體內的復制，從而使病毒感染造成的損傷加重的結果相類似。另外，本研究結果顯示PRRSV組IFN-γ mRNA轉錄水平與PRRSV轉錄水平存在弱負相關關系，表明PRRSV在PAMs細胞內的增殖復制抑制了IFN-γ的產生，這也是PRRSV導致機體免疫抑制的機制之一。

研究結果對于臨床用藥具有一定的指導意義，結果表明PRRSV感染后可用PHA等藥物或促進劑刺激干擾素的產生，對PRRSV的復制增殖具有一定的抑制作用，這與臨床中用干擾素治療PRRSV豬只的研究類似[14]；DEX是糖皮質激素類藥物，雖具有抗炎、抗過敏和抗毒作用，但本研究結果顯示DEX抑制IFN-γ的產生，從而促進了PRRSV的增殖復制，因此PRRSV感染后不建議使用DEX，這與佟杰等[13]連續7 d低劑量注射DEX會造成仔豬機體免疫抑制，增加其死亡率的結果一致。

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(編輯：侯向輝)

The Effects of PRRSV Infected PAMs on Transcription Levels of IFN-γinVitro

YAN Xiao-xia, LIU Huan-huan, ZENG Meng-ying, GAO Hong, YAN Yu-lin*

(CollegeofAnimalScienceandTechnology,YunnanAgriculturalUniversity,Kunming, 650201,China)

To explore the effects of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) infected pulmonary alveolar macrophage (PAMs) on transcription levels of IFN-γinvitro，three four weeks old piglet free of PRRSV was used in this experiment. The PAMs were isolated aseptically and divided into control group, PRRSV infection group (PRRSV group),PRRSV+PHA group，PRRSV+Dex group and culturedinvitro. The PAMs were collected at 6, 12, 24, 48 and 60 hours post infection. The mRNA transcription of IFN-γ and PRRSV were analyzed by Real-Time PCR. The results shows that the mRNA levels of PRRSV in PRRSV group were gradually increased at 6～24 h and were decreased at 48 h ; the transcription of IFN-γ were gradually increased at 6～48 and significantly higher at 24 and 48 h than control group. PRRSV+PHA group the mRNA levels of PRRSV were slightly lower and the IFN-γ is higher than PRRSV group; RRRSV+Dex group the mRNA transcription of PRRSV were higher but the IFN-γ is lower.The results indicated IFN-γ can inhibit the proliferation of PRRSV in PAMs，the inhibition of IFN -γ is probably one of the mechanisms that PRRSV cause cellular damage.

PRRSV；PAMs；IFN-γ

2016-07-07

A

1002-1280 (2016) 10-0001-05

S852.65

國家自然科學基金項目(31160496，31360599)；云南農業大學2015年研究生科技創新項目(2015ykc4)