不同年齡麥洼牦牛腸道菌群的分離鑒定及其群落結構的變化

聶遠洋，鄧 岳，劉戎梅，官久強，羅曉林，孫 群

（1.四川大學生命科學學院生物資源與生態環境教育部重點實驗室，四川 成都 610064；2.瀘州職業技術學院，四川 瀘州 646000；3.四川省草原科學研究院，四川 成都 611731）

不同年齡麥洼牦牛腸道菌群的分離鑒定及其群落結構的變化

聶遠洋1，鄧 岳2，劉戎梅1，官久強3，羅曉林3，孫 群1

（1.四川大學生命科學學院生物資源與生態環境教育部重點實驗室，四川 成都 610064；2.瀘州職業技術學院，四川 瀘州 646000；3.四川省草原科學研究院，四川 成都 611731）

為了解麥洼牦牛腸道細菌群落結構組成和功能及其動態變化過程，同時獲得具有潛在益生菌活性和應用可能性的腸道菌株，采用不同的培養基在不同的培養條件下分離麥洼牦牛腸道細菌并進行16S rDNA分子鑒定，同時采用變性梯度凝膠電泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）技術分析不同年齡麥洼牦牛腸道細菌的群落結構和功能及其差異。結果表明，從不同年齡麥洼牦牛大腸內容物中共分離到90株細菌，其中3株歸為放線菌門（Actinobacteria），64株為厚壁菌門（Firmicutes），23株為變形菌門（Proteobacteria）；分離到的34株芽孢桿菌屬（Bacillus）和14株乳酸桿菌屬（Lactobacillus）細菌具有潛在益生菌活性，可作為微生物飼料添加劑補飼麥洼牦牛；對DGGE圖譜的UPGMA聚類、PCA和多樣性指數分析顯示，不同年齡的麥洼牦牛腸道細菌的群落結構有差異，相同年齡的個體相似度較高，而不同年齡的個體相似度較小，較大年齡（2.5和3.5歲）的牦牛腸道菌群多樣性大于較小年齡個體（0.5和1.5歲），且分布更均勻，腸道菌群隨宿主年齡變化是一個動態變化并趨于穩定的過程；DGGE條帶的物種鑒定結果表明，大部分條帶為未（能）培養細菌，PCR-DGGE與分離培養法結合可以很好地表征麥洼牦牛腸道菌群的結構和功能。

腸道菌群；牦牛；培養法；16S rDNA；PCR-DGGE

0 引 言

牦牛（Yak，Bos grunniens）是高寒地區的特有牛種，草食性反芻家畜，也是我國的主要牛種之一，主要產于青藏高原海拔3000m以上地區。麥洼牦牛是在川西北高寒生態條件下經長期自然選擇和人工選擇形成的乳、肉性能良好的草地型牦牛品種，對高寒草地特別是沼澤草地有良好的適應性，是四川省群體數量最大的牦牛地方品種[1]。牦牛具有奶、肉、絨、皮等多種經濟用途，且具有風味獨特、品質優良的奶和肉，來自高原地區的牦牛產品正以其無污染的特色野味逐漸受到人們的青睞[2]。

牦牛的腸道是其消化和吸收營養物質的主要場所，直接關系到牦牛的營養與健康。其腸道內共生著大量細菌，能進一步分解食物殘渣和植物纖維，促進牦牛對營養物質的吸收[3]。腸道正常菌群在一般情況下不會致病，一些腸道細菌還能利用腸道內簡單的物質合成維生素B和維生素K等；但由于牦牛的主產區青藏高原海拔較高、氣候嚴寒惡劣、冷季草料匱乏，易導致牦牛掉膘、生病和死亡等冷季損失問題，因此深入了解牦牛腸道微生物的群落結構對牦牛的營養具有十分重要的意義。目前關于系統深入地研究牦牛腸道微生物的群落結構和功能，以及它們的動態變化和與牦牛營養代謝的潛在關聯還鮮見報道，少量的研究大都集中于其腸道微生物的分離培養鑒定，且與疾病的防控相關[4-5]。

傳統培養法存在只能反映少數微生物的信息、檢測結果誤差較大、易漏掉具有應用價值的微生物資源等問題[6]，但這種方法在分離具有一定特殊功能的目標微生物時非常有用，許多微生物資源的開發與利用還是要依賴傳統的微生物培養技術[5，7]。PCRDGGE指紋圖譜技術在研究復雜微生物區系的遺傳多樣性和種群差異等方面具有獨特的優勢，目前已成為分析微生物群落結構和動態變化廣泛采用的技術[8]。而隨著大規模測序技術的發展，宏基因組學（Metagenomics）以環境中未培養微生物為研究對象，近年來在微生物生態學和環境微生物學研究中得到了快速的發展[9-10]，這一技術在揭示未發現的物種存在，以及鑒定微生物組的部分基因功能和不同微生物的基因功能差異等方面具有更加強大的功能，因此也成為目前腸道微生物研究重點采用的技術[11]。本研究采用不同的培養基在不同的培養條件下分離麥洼牦牛腸道細菌并進行16S rDNA分子鑒定，分析討論獲得的菌株的益生菌活性和應用可能性；同時采用PCR-DGGE技術分析不同年齡麥洼牦牛腸道細菌的群落結構和功能及其差異，分析并討論腸道菌群隨宿主年齡的動態變化過程。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑

細菌基因組DNA提取試劑盒，北京天根公司；Stool DNA Kit，Gel Extraction Kit，美國OMEGA公司；日本Takara公司；SYBR Green I核酸染料，美國Sigma公司；LB培養基（LB）、腦心浸液肉湯培養基（BHI）和厭氧瓊脂培養基（SAA），青島海博生物技術有限公司。

1.1.2 主要儀器

S1000TMPCR儀，WIDE型電泳槽，PowerPacTMBasic型電泳儀，UniversalHood II型凝膠成像系統，DCodeTMUniversal Mutation Detection System，美國Bio-Rad公司；LEGEND MICRO 21R型高速冷凍離心機，1389型生物安全柜（A2），美國Thermo Fisher Scientific公司；AFZ-1002-U型超純水儀，艾科浦公司；厭氧密封培養罐（2.5L和7.0L），日本三菱瓦斯化學株式會社；DHP-9162型電熱恒溫培養箱，上海一恒科學儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集

所有麥洼牦牛腸道內容物樣品采自四川省阿壩藏族羌族自治州紅原縣肉聯廠，各年齡階段（0.5，1.5，2.5，3.5歲）的麥洼牦牛均由四川省草原科學研究院規范化養殖，在屠宰時剪取牦牛的大腸（含內容物）并分別冷藏保存，用于分離微需氧菌和完全厭氧菌的樣品則迅速放入厭氧密封罐（分別含微氧產氣袋和完全厭氧產氣袋）中冷藏保存。分別取到各年齡階段的麥洼牦牛腸道內容物樣品各5份。

1.2.2 菌株分離純化

取麥洼牦牛腸道內容物用無菌水分散后涂布于新鮮制備的LB培養基平板和腦心浸液肉湯培養基平板上，置于37℃恒溫培養箱中培養1～2d，待長出單菌落后用接種環挑取單菌落劃線轉接至新鮮的LB培養基平板和腦心浸液肉湯培養基平板上，按前述方法培養1～2d，如此反復挑取單菌落純化至得到純培養，并分別甘油保藏和真空冷凍干燥保藏菌種。

取用于分離微需氧菌和完全厭氧菌的樣品用無菌水分散后分別涂布于新鮮制備的厭氧瓊脂培養基平板上，迅速置于厭氧培養盒中，向盒子的水槽中倒入少量無菌水，然后分別放入微氧產氣包（5%氧氣殘留）和完全厭氧產氣包（無氧氣殘留），迅速蓋上盒子的密封蓋，將厭氧盒置于37℃恒溫培養箱中培養5～7d，待長出單菌落后用接種環挑取單菌落劃線轉接至新鮮的厭氧瓊脂培養基平板上，按前述方法培養5～7d，如此反復挑取單菌落純化至得到純培養，并分別甘油保藏和真空冷凍干燥保藏菌種。

1.2.3 基因組DNA提取

采用TIANGEN公司細菌基因組DNA提取試劑盒提取分離純化的細菌基因組DNA，采用OMEGA公司Stool DNA Kit試劑盒提取麥洼牦牛腸道內容物樣品的總基因組DNA，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取結果。

1.2.4 16S rDNA擴增和膠回收

PCR引物序列[8]為：27F 5′-AGAGTTTGATCMTG GCTCAG-3′，1492R 5′-TACGGYTACCTTGTTACGA CTT-3′。50 μL體系：4 μL模板DNA，上下游引物各2μL，25μL 2×Taq PCR MasterMix（Loading dye mix），17 μL ddH2O。擴增條件：94℃預變性5 min；94℃，30 s，58℃，45s，72℃，90s，30個循環；最后72℃，延伸7min。陰性對照用ddH2O作為模板。擴增結束后，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，以凝膠成像系統采集圖片并進行結果分析。采用OMEGA公司的Gel Extraction Kit回收瓊脂糖凝膠中的16S rDNA，并用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測回收結果。

PCR引物序列[8]為：HDA1-GC 5′-CGCCCGGGG CGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGACT CCTACGGGAGGCAGCAGT-3′，HDA2 5′-GTATTAC CGCGGCTGCTGGCAC-3′。50 μL體系：4 μL模板DNA（膠回收后的腸道內容物總基因組DNA的16S rDNA擴增產物），上下游引物各2 μL，25 μL 2×Taq PCR MasterMix（Loading dye mix），17μL ddH2O。擴增條件：94℃預變性5min；94℃，30s，53℃，30s，68℃，30s，30個循環；最后68℃，延伸7min。陰性對照用ddH2O作為模板。擴增結束后，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，以凝膠成像系統采集圖片并進行結果分析。

1.2.6 DGGE

制備8%聚丙烯酰胺凝膠，變性梯度濃度為35%～65%，呈線性增加，梯度方向與電泳方向平行，加入20μL含有適量上樣緩沖液的16S rDNA V3區PCR擴增產物。電泳時，溫度為60℃，電壓為120V，運行6h。電泳后用SYBR Green I進行染色，染料用1×TAE以1∶10 000稀釋，每次染液用量15 mL，染色15min，共染3次。染色完后用凝膠成像系統采集圖片并用Quantity One 4.6.9軟件分析結果。

1.2.7 物種鑒定

將膠回收后的各分離菌株的16S rDNA送至英濰捷基（上海）貿易有限公司測序，獲得的序列分別在NCBI BLAST上比對并分析結果。將DGGE凝膠上的特征條帶切下，加入50～100 μL ddH2O，在4℃冰箱放置過夜，使膠條中的DNA釋放出來，以此為模板，用不含GC夾子的V3區引物擴增，反應體系和條件同前1.2.5，擴增產物送英濰捷基（上海）貿易有限公司測序，將獲得的序列在NCBI BLAST數據庫中比對后獲得物種信息。

1.2.8 統計分析

采用Quantity One 4.6.9軟件將DGGE圖譜的DNA條帶亮度數字化，根據香農指數（H′）、豐富度（S）和均勻度（EH）的計算公式分別計算得到麥洼牦牛腸道菌群的香農指數、豐富度和均勻度，以分析各樣品中細菌的種群多樣性及分布的均勻性。各指數的計算式如下式所示：

式中：Pi——某一條帶的亮度與同泳道中所有條帶總亮度的比值；

整個一體化五防系統內所有五防主/子站、電腦鑰匙均具備黑匣子功能，即：系統對全時段所有倒閘操作情況進行記錄，包括各操作任務的已/未執行項及時間、異常操作等詳細信息；并可按操作類型、電壓等級、操作時間等任意定制關鍵字對記錄數據進行查尋、調閱；記錄在電腦鑰匙中的信息可調閱但無法刪除；最大記錄項數2000項，掉電記憶達5年。系統提供將所需數據根據可調模板制作電子數據并打印。

S——每一泳道中總的條帶數目。

實驗數據均以均值±標準差表示，采用SPSS 17.0軟件的One-way ANOVA進行方差分析，并用LSD法和Dunnett’s T3法進行事后兩兩比較分析。采用Canoco for Windows 4.5軟件進行PCA分析。

2 結果與分析

2.1 麥洼牦牛腸道細菌的分離鑒定結果

采用LB和BHI培養基分離需氧菌，采用SAA培養基分別在微氧（5%氧氣）和無氧條件下分離微需氧菌和厭氧菌，分離菌株的鑒定結果和分類見表1。從不同年齡麥洼牦牛大腸內容物中共分離到90株細菌，主要歸為放線菌門（Actinobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）和變形菌門（Proteobacteria），其中絕大多數菌株屬于厚壁菌門（64株）和變形菌門（23株）細菌，放線菌門細菌僅有3株，而擬桿菌門（Bac teroidetes）細菌則未分離到。在屬的水平上，85%以上的菌株歸屬于芽孢桿菌屬（Bacillus）、埃希氏桿菌屬（Escherichia）、乳桿菌屬（Lactobacillus）和鏈球菌屬（Streptococcus）這4個屬，分別有34，20，14，10株細菌。從分離培養條件來看，得到的需氧菌數量（57株）要遠高于微需氧菌（12株）和厭氧菌（21株）。

表1 基于16S rRNA基因序列比對后的麥洼牦牛腸道菌株親緣關系分類1）

2.2 麥洼牦牛腸道菌群16S rDNA V3區DGGE圖譜

不同年齡（0.5，1.5，2.5，3.5歲）麥洼牦牛腸道菌群的DGGE圖譜如圖1所示，圖中各泳道的條帶數量和亮度的差異反映了各樣品中腸道細菌種群多樣性和含量的差異。總體來看，在條帶數量上2.5和3.5歲麥洼牦牛最多，其次是1.5歲，而0.5歲最少，表明4個不同年齡階段的麥洼牦牛其腸道細菌種群多樣性存在一定的差異；在特征優勢條帶上0.5和1.5歲麥洼牦牛明顯多于2.5歲，也就是說0.5和1.5歲麥洼牦牛含有更多豐度較高的優勢細菌種群，而2.5和3.5歲麥洼牦牛腸道菌群的分布較為均一，表明麥洼牦牛在生長過程中腸道菌群的多樣性及分布趨于穩定和均一。

2.3 UPGMA聚類分析和PCA分析

采用Quantity One 4.6.9軟件的UPGMA算法對DGGE圖譜進行聚類分析，以了解不同年齡麥洼牦牛腸道細菌物種類型和豐度在總體水平上相似度的差異，聚類結果如圖2（a）所示。從圖中可以看出，同一年齡的麥洼牦牛在腸道細菌物種類型和豐度的總體水平上最先聚為一類，且相似值達到0.70以上，說明細菌群落結構差異較小，而不同年齡麥洼牦牛的聚類距離最遠，細菌群落結構差異較大。采用Quantity One 4.6.9軟件將DGGE圖譜的每一個泳道（樣品）的每一個條帶的亮度轉換為數值，并用Canoco for Windows 4.5軟件進行PCA分析，結果如圖2（b）所示。從圖中可以看出，同組樣品間距離較小，能大致聚在一起，而不同組間則距離較遠，0.5和1.5歲兩組間的個體樣本距離較近，而與2.5和3.5歲組內個體樣本距離都較遠，與DGGE圖譜和UPGMA聚類分析結果一致。

圖1 麥洼牦牛腸道菌群16S rDNA V3區DGGE圖譜

圖2 不同年齡麥洼牦牛腸道菌群DGGE圖譜的UPGMA聚類分析和PCA分析

2.4 不同年齡麥洼牦牛腸道菌群的多樣性指數分析

分別計算得到不同年齡麥洼牦牛腸道菌群的香農指數（H′）、豐富度（S）和均勻度（EH），以分析各樣品中細菌種群多樣性及分布的均勻性，結果如表2所示。從表中可以看出3.5和2.5歲麥洼牦牛腸道菌群的香農指數、豐富度和均勻度均顯著性高于1.5和0.5歲（P＜0.05），表明不同年齡階段的麥洼牦牛腸道細菌種群多樣性和分布均一性存在顯著性差異，與直觀的DGGE圖譜分析結果一致；而0.5和1.5歲麥洼牦牛腸道菌群的香農指數、豐富度和均勻度則沒有顯著性差異（P＞0.05）；2.5和3.5歲麥洼牦牛腸道菌群的香農指數、豐富度和均勻度也沒有顯著性差異（P＞0.05）。

表2 不同年齡麥洼牦牛腸道菌群的香農指數、豐富度和均勻度顯著性差異分析（N=5）1）

2.5 麥洼牦牛腸道菌群DGGE圖譜的特征條帶回收及物種鑒定

從不同年齡麥洼牦牛腸道菌群DGGE圖譜中切膠回收了42個特征條帶，通過PCR擴增、膠回收、測序和NCBI BLAST序列比對后得到各條帶代表的物種信息，如表3所示。麥洼牦牛腸道菌群絕大部分為未（能）培養細菌，其中相對豐度較多的主要有梭菌屬（Clostridium）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、消化鏈球菌屬（Peptostreptococcus）和瘤胃球菌科（Ruminococcaceae）的細菌，這些細菌也主要存在于幼年時期（0.5和1.5歲）麥洼牦牛的腸道中，它們構成了幼年麥洼牦牛的腸道優勢菌群。而隨著麥洼牦牛的成長（2.5和3.5歲），這些優勢菌群的豐度逐漸減少，另外一些新的菌屬的細菌被檢測到，如微桿菌屬（Microbacterium）、疣微菌屬（Verrucomicrobia）、放線菌屬（Actinobacterium）、Akkermansia sp.、脫硫弧菌屬（Desulfovibrio）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）、毛螺菌科（Lachnospiraceae）、優桿菌科（Eubacteriaceae）、綠彎菌綱（Chloroflexi）等細菌，這些細菌也是麥洼牦牛腸道中的正常菌群，它們增加了其宿主腸道菌群的多樣性和均勻性，更有助于成年（＞2歲）麥洼牦牛對草料類食物的消化和營養的吸收。

表3 麥洼牦牛腸道菌群DGGE圖譜的特征條帶序列比對結果

3 討論與結論

3.1 麥洼牦牛腸道菌群中的潛在益生菌資源

本研究中采用不同培養基和不同的培養條件從麥洼牦牛大腸內容物中分離可培養細菌，其中分離到的最多的是芽孢桿菌屬（Bacillus）的細菌，共有34株，常見的有枯草芽孢桿菌、蠟樣芽胞桿菌、解淀粉芽孢桿菌、甲基營養型芽孢桿菌、韋氏芽孢桿菌、簡單芽孢桿菌、短小芽孢桿菌和凝結芽孢桿菌等。我國于1994年法定乳酸桿菌、芽孢桿菌、糞鏈球菌、酵母菌和雙歧桿菌等是可用于微生態制劑生產的主要菌種[12]。因為芽孢桿菌的芽孢可耐長期貯存，所以一般將芽孢作為益生菌產品開發生產，常用于飼料添加劑的芽孢桿菌屬的細菌主要有枯草芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌和凝結芽孢桿菌等[13]。乳酸桿菌是其作為微生物飼料添加劑而研究最多且應用最廣泛的一類益生菌[14]，其在動物腸道內繁殖屬于正常菌種，而且可產生多種抑制性化合物和對抗性物質以及有機酸等，這些有機酸本身就是動物生長所需的營養物質，同時還能降低腸道內的pH值，從而抑制其他致病菌和腐敗菌的增殖。因此，本研究中分離到的大量芽孢桿菌屬和乳酸桿菌屬的細菌可在后續的實驗中檢測其益生菌活性和安全性，并作為益生菌劑直接補飼麥洼牦?；蛘咛砑拥角噘A飼草中再補飼麥洼牦牛，以提高其生產性能和減少在冷季的損失。

當然，培養法中所使用的分離培養基的種類及其營養成分的豐富程度也對分離到的細菌種類和數量有直接的影響，比如本研究中所使用的腦心浸液肉湯培養基，其營養成分相對豐富，因此相對另外兩種培養基而言，其分離到的菌群種類和數量都最多。但是動物腸道的可培養微生物畢竟只占很小的一部分，要了解麥洼牦牛整個腸道微生物的群落結構和功能，還需要其他分子生物學的非培養法的結合研究，而DGGE條帶的鑒定結果表明大部分的條帶為未（能）培養細菌，因此兩種方法結合可更加全面地了解麥洼牦牛腸道菌群的結構和功能。

3.2 不同年齡麥洼牦牛腸道菌群的群落結構動態變化

對DGGE圖譜中不同樣本的UPGMA聚類、PCA和多樣性指數分析，結果表明不同年齡的麥洼牦牛其腸道菌群的群落結構都有一定的差異，表現為相同年齡的個體相似度較高，聚類和PCA結果也聚為一類，而不同年齡間的個體相似度較小，聚類和PCA距離較遠；在多樣性指數（香農指數、豐富度和均勻度）的差異上，0.5和1.5歲之間無顯著性差異，2.5和3.5歲之間也無顯著性差異，而較大年齡組（2.5和3.5歲）顯著性高于較小年齡組（0.5和1.5歲），表明較大年齡的麥洼牦牛其腸道菌群的多樣性大于較小年齡個體，且分布更均勻，腸道菌群隨宿主的年齡變化是一個動態變化并趨于穩定的過程。分析其原因可能是食物的影響，動物從出生到成年其腸道菌群是一個從不斷定植到逐漸穩定的過程[15]，麥洼牦牛在較小年齡時未完全斷奶，奶和草同時進食，而成年后（一般2歲左右）只食草料，腸道菌群也已完成定植，因此表現為更高的多樣性和均勻性。

4 結束語

腸道菌群可以受到來自宿主方面的很多影響，如食物、年齡、抗生素的使用情況、健康狀況等，同時也可以受很多環境因子的影響，如生活地域、季節和飼養條件等[8]。本研究采用PCR-DGGE技術分析了不同年齡麥洼牦牛腸道細菌的群落結構及其差異，證實了麥洼牦牛腸道菌群隨宿主的年齡變化是一個動態變化并趨于穩定的過程，表現為成年麥洼牦牛的腸道菌群具有更高的多樣性和均勻性。并采用不同的培養基在不同的培養條件下分離到90株麥洼牦牛腸道細菌，其中34株芽孢桿菌屬和14株乳酸桿菌屬細菌具有潛在益生菌活性，經驗證后可作為微生物飼料添加劑用于補飼麥洼牦牛，以提高其生產性能和減少在冷季的損失。

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（編輯：莫婕）

Isolation and identification of gut microbiota with community structure changes in different ages of Maiwa yaks

NIE Yuanyang1，DENG Yue2，LIU Rongmei1，GUAN Jiuqiang3，LUO Xiaolin3，SUN Qun1
（1.Key Laboratory of Bio-resource and Bio-environment，College of Life Sciences，Sichuan University，Chengdu 610064，China；2.Luzhou Vocational and Technical College，Luzhou 646000，China；3.Sichuan Grassland Science Academy，Chengdu 611731，China）

To understand the community structure composition，functions and dynamic changes of Maiwa yaks’gut microbiota and obtain the gut bacterial strain of Maiwa yaks with Potential probiotic activity and application possibility，different culture mediums were used to separate the intestinal bacteria of Maiwa yaks under different culture conditions，and 16S rDNA molecular identification was also carried out.In the meantime，denaturing gradient gel electrophoresis（DGGE）technology was also applied to analyze the community structure and function and the difference of intestinal bacteria of Maiwa yaks at different ages.The results showed that totally 90 strains of bacteria were separated from the gut content of Maiwa yaks at different ages，in which 3，64，and 23 strains were classified as the phylum ofActinobacteria， Firmicutes and Proteobacteria respectively.Totally 34 strains of the genus Bacillus and 14 strains of the genus Lactobacillusbacteria with potential probiotic activity were also separated，and they can be used as microbial feed additives to Maiwa yak supplementary feeding.Analysis of UPGMA clustering，PCA，and diversity index of DGGE spectrum indicated that the community structure of gut microbiota at different ages is different，and the similarity between animals of the same ages is high，while the similarity between different ages of animals is low.The diversity of gut microbiota of elder groups of Maiwa yaks(2.5 and 3.5 years)is significantly higher than that of younger groups(0.5 and 1.5 years)but with more homogeneous distribution，which indicates that the change of gut microbiota along with the age change of host is a dynamic process tending to be stable.Species identification results of DGGE bands showed that most of the bands were uncultured bacteria，further indicating that the method of combining PCR-DGGE with plate-culture method can be a more comprehensive way to characterize the structure and function of gut microbiota of Maiwa yaks.

gut microbiota；yak；culture-dependent method；16S rDNA；PCR-DGGE

A

：1674-5124（2016）12-0053-07

10.11857/j.issn.1674-5124.2016.12.012

2016-08-09；

：2016-09-21

四川省科技支撐計劃課題（2016NZ0005）

聶遠洋（1986-），男，重慶市人，博士，研究方向為資源微生物。

孫 群（1967-），女，四川成都市人，教授，博士，研究方向為微生物技術與食品安全。