甘蔗重要病害分子檢測技術(shù)

李文鳳, 王曉燕, 黃應(yīng)昆, 單紅麗, 張榮躍, 尹 炯, 羅志明

(云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所, 云南省甘蔗遺傳改良重點實驗室, 開遠(yuǎn) 661699)

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甘蔗重要病害分子檢測技術(shù)

李文鳳, 王曉燕, 黃應(yīng)昆*, 單紅麗, 張榮躍, 尹 炯, 羅志明

(云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所, 云南省甘蔗遺傳改良重點實驗室, 開遠(yuǎn) 661699)

快速有效地對甘蔗重要病害病原進(jìn)行診斷檢測,明確監(jiān)測病害的病原是科學(xué)有效防控甘蔗病害的基礎(chǔ)和關(guān)鍵。云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所通過探索研究、改進(jìn)創(chuàng)新、優(yōu)化建立了甘蔗黑穗病、銹病、白條病、宿根矮化病、赤條病、花葉病、斐濟(jì)病、黃葉病、桿狀病毒病和白葉病等10種重要病害13種病原的分子快速檢測技術(shù),為甘蔗病害的有效診斷和防控、脫毒健康種苗檢測及引種檢疫提供了技術(shù)支撐。

甘蔗; 重要病害; 分子檢測

在推進(jìn)現(xiàn)代甘蔗產(chǎn)業(yè)過程中,甘蔗病害是甘蔗生產(chǎn)最大的威脅之一。尤其近年來,境外引種、蔗區(qū)間相互頻繁調(diào)種,為甘蔗重要病害的傳播蔓延提供了條件,再加上蔗區(qū)生態(tài)的多樣化和復(fù)雜化,病原致病性的分化,導(dǎo)致蔗區(qū)甘蔗病害病原種類復(fù)雜多樣,給我國的甘蔗安全生產(chǎn)帶來了嚴(yán)重隱患[1-7]。對不同生態(tài)蔗區(qū)甘蔗重要病害病原進(jìn)行適時、有效地診斷檢測,探明主要病害病原種類、主要株系(小種)類群及其遺傳多樣性,明確監(jiān)測病害的病原是科學(xué)有效防控甘蔗病害的基礎(chǔ)和關(guān)鍵[8]。

近年來,云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所在國家和云南省甘蔗產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系“甘蔗病害檢測技術(shù)研究”等項目支持下,開展了甘蔗病毒病、宿根矮化病、黑穗病和銹病等主要病害快速檢測技術(shù)的研究,建立并優(yōu)化了甘蔗黑穗病、銹病、宿根矮化病、花葉病、黃葉病、桿狀病、條紋花葉病和白葉病等重要病害分子快速檢測技術(shù),為甘蔗病害的有效診斷和防控、脫毒健康種苗檢測及引種檢疫提供了技術(shù)支撐。現(xiàn)將上述各病害檢測技術(shù)介紹如下。

1 甘蔗黑穗病(smut)PCR檢測技術(shù)

1.1 DNA的提取

取0.5 g 甘蔗黑穗病菌(UstilagoscitamineaSydow)孢子或病部組織于研缽中,加入液氮研磨成粉狀。采用DNA Kit植物DNA提取試劑盒提取葉片總DNA,具體步驟按照說明書操作,提取后用Eppendorf AG 22331蛋白/核酸分析儀鑒定DNA質(zhì)量。

1.2 擴(kuò)增甘蔗黑穗病菌的特異性引物

引物序列采用文獻(xiàn)[9]報道的根據(jù)甘蔗黑穗病菌(U.scitaminea)基因組bE交配型基因核苷酸保守序列設(shè)計的特異性引物,其序列為上游引物bE4:5′-CGCTCTGGTTCATCAACG-3′; 下游引物bE8:5′-TGCTGTCGATGGAAGGTGT-3′,目的片段長度為420 bp。

1.3 PCR檢測

25 μL PCR擴(kuò)增體系中含10×PCR buffer 2.5 μL,25 mmol/L MgCl22.0 μL,10 mmol/L dNTPs 1.0 μL,Taq(5 U/μL) 0.2 μL,上、下游引物(10 μmol/L)各2.0 μL,DNA 模板2 μL,加滅菌超純水至25 μL。PCR 反應(yīng)程序:94℃預(yù)變性4 min;94℃ 30 s,55℃ 30 s,72℃ 1 min 延伸,35個循環(huán);最后72℃ 延伸10 min。每個樣品進(jìn)行3次重復(fù)擴(kuò)增檢測。

1.4 結(jié)果及判別

取10 μL PCR 反應(yīng)產(chǎn)物于1.0 % 瓊脂糖凝膠上電泳,用BIO-RAD凝膠成像系統(tǒng)觀察、判別結(jié)果,擴(kuò)增出420 bp條帶的為陽性,未擴(kuò)增出420 bp條帶的為陰性。

2 甘蔗銹病(orange rust和brown rust)PCR檢測技術(shù)

2.1 甘蔗橙銹病菌[Puccinia kuehnii(Kruger)Butler]PCR檢測技術(shù)

2.1.1 DNA的提取

取甘蔗橙銹病病葉0.2 g,采用DNA Kit植物DNA提取試劑盒提取葉片總DNA,具體步驟按照說明書操作,提取后用Eppendorf AG 22331蛋白/核酸分析儀鑒定DNA質(zhì)量。

2.1.2 擴(kuò)增甘蔗橙銹病菌的特異性引物

引物序列采用文獻(xiàn)[10]報道的根據(jù)甘蔗橙銹病菌(P.kuehnii)基因組 ITS 區(qū)域保守序列設(shè)計的特異性引物,其序列為上游引物Pk1-F:5′-AAGAGTGCACTTAATTGTGGCTC-3′;下游引物Pk1-R:5′-CAGGTAACACCTTCCTTGATGTG-3′,目的片段長度為527 bp。

2.1.3 PCR檢測

25 μL PCR擴(kuò)增體系中含ddH2O 10 μL、2×PCRTaq混合物12.5 μL、DNA模板0.5 μL、上、下游引物(20 μg/μL)各1.0 μL。PCR反應(yīng)程序:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s,56℃退火1 min,72℃延伸30 s,35個循環(huán);最后72℃延伸7 min。每個樣品進(jìn)行3次重復(fù)擴(kuò)增檢測。

2.1.4 結(jié)果及判別

取10 μL PCR 反應(yīng)產(chǎn)物于1.5 % 瓊脂糖凝膠上電泳,用BIO-RAD凝膠成像系統(tǒng)觀察、判別結(jié)果,擴(kuò)增出527 bp條帶的為陽性,未擴(kuò)增出527 bp條帶的為陰性。

2.2 甘蔗褐銹病菌(Puccinia melanocephala H.Sydow & P.Sydow)PCR檢測技術(shù)

2.2.1 DNA的提取

取甘蔗褐銹病病葉0.2 g,采用DNA Kit植物DNA提取試劑盒提取葉片總DNA,具體步驟按照說明書操作,提取后用Eppendorf AG 22331蛋白/核酸分析儀鑒定DNA質(zhì)量。

2.2.2 擴(kuò)增甘蔗褐銹病菌的特異性引物

引物序列采用文獻(xiàn)[10]報道的根據(jù)甘蔗褐銹病菌P.melanocephala基因組ITS 區(qū)域保守序列設(shè)計的特異性引物,其序列為上游引物Pm1-F:5′-AATTGTGGCTCGAACCATCTTC-3′;下游引物Pm1-R:5′-TTGCTACTTTCCTTGATGCTC-3′,目的片段長度為480 bp。

2.2.3 PCR檢測

25 μL PCR擴(kuò)增體系中含ddH2O 10 μL、2×PCRTaq混合物12.5 μL、DNA模板0.5 μL、上、下游引物(20 μg/μL)各1.0 μL。PCR反應(yīng)程序:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s,56℃退火1 min,72℃延伸30 s,35個循環(huán);最后72℃延伸7 min。每個樣品進(jìn)行3次重復(fù)擴(kuò)增檢測。

2.2.4 結(jié)果及判別

取10 μL PCR 反應(yīng)產(chǎn)物于1.5 % 瓊脂糖凝膠上電泳,用BIO-RAD凝膠成像系統(tǒng)觀察、判別結(jié)果,擴(kuò)增出480 bp條帶的為陽性,未擴(kuò)增出480 bp條帶的為陰性。

3 甘蔗白條病(leaf scald)PCR檢測技術(shù)

3.1 樣品采集與處理

于甘蔗成熟期采樣檢測,采用五點取樣法,每個樣品取10株,每株截取中下部莖節(jié)各1節(jié),每節(jié)切成約7 cm長,縱向“十字”剖為4份,再用鉗子擠壓蔗莖,共取約25 mL的蔗汁于50 mL離心管內(nèi)混勻,樣品放于冰箱中,于-20℃保存待用。每取一個樣品后,取樣工具先用清水沖洗,再用75%乙醇進(jìn)行消毒。

3.2 樣品制備

取采集的蔗汁1.5 mL放入離心管中,13 000 r/min離心3 min,棄上清液,向沉淀中加入1 000 μL滅菌水,13 000 r/min重復(fù)操作2次,向沉淀中加入20～200 μL滅菌水,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3.3 擴(kuò)增甘蔗白條病菌的特異性引物

引物序列采用文獻(xiàn)[11]報道的根據(jù)甘蔗白條病菌[Xanthomonasalbilineans(Ashby) Dowson]基因組保守序列設(shè)計的特異性引物,其序列為上游引物XaF:5′-CCTGGTGATGACGCTGGGTT-3′;下游引物XaR:5′-CGATCAGCGATGCACGCAGT-3′,目的片段長度為600 bp。

3.4 PCR檢測

25 μL PCR擴(kuò)增體系中含10× PCR buffer 2.5 μL,25 mmol/L MgCL22.0 μL,10 mmol/L dNTPs 1.0 μL,上、下游引物(20 μg/μL)各0.5 μL,5UTaq聚合酶 0.2 μL,DNA模板1.0 μL,ddH2O 17.3 μL。PCR反應(yīng)條件為:95℃ 5 min;94℃ 45 s,65℃ 1 min,72℃ 1 min,10 個循環(huán);94℃ 45 s,65℃ 1 min,72℃ 2 min,10個循環(huán);94℃ 45 s,65℃ 1 min,72℃ 3 min,10 個循環(huán);72℃ 10 min。每個樣品進(jìn)行3次重復(fù)擴(kuò)增檢測。

3.5 結(jié)果及判別

取10 μL PCR 反應(yīng)產(chǎn)物于1.0 % 瓊脂糖凝膠上電泳,用BIO-RAD凝膠成像系統(tǒng)觀察、判別結(jié)果,擴(kuò)增出600 bp條帶的為陽性,未擴(kuò)增出600 bp條帶的為陰性。

4 甘蔗宿根矮化病(RSD)PCR檢測技術(shù)

4.1 樣品采集與處理

與甘蔗白條病相同。

4.2 DNA的提取

每個樣品取2 000 μL蔗汁放入離心管中,12 000 r/min離心10 min,棄上清液。采用DNA Kit植物DNA提取試劑盒提取葉片總DNA,具體步驟按照說明書操作,提取后用Eppendorf AG 22331蛋白/核酸分析儀鑒定DNA質(zhì)量。

4.3 擴(kuò)增甘蔗宿根矮化病菌的特異性引物

引物采用文獻(xiàn)[12]報道的根據(jù)甘蔗宿根矮化病菌[Leifsoniaxylisubsp.xyli(Lxx)]16S-23S rDNA基因間隔區(qū)保守序列設(shè)計的特異性引物,其序列為上游引物L(fēng)xx1:5′-CCGAAGTGAGCAGATTGACC-3′,下游引物L(fēng)xx2:5′-ACCCTGTGTTGTTTTCAACG-3′;目的片段長度為438 bp。

4.4 PCR檢測

20 μL PCR擴(kuò)增體系中含ddH2O 8.6 μL,2×PCRTaqmix 8 μL,DNA模板3 μL,上、下游引物(20 μg/μL)各0.2 μL;PCR反應(yīng)程序為:95℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s,56℃退火30 s,72℃延伸1 min,35個循環(huán);72℃延伸5 min。每個樣品進(jìn)行3次重復(fù)擴(kuò)增檢測。

4.5 結(jié)果及判別

取10 μL PCR 反應(yīng)產(chǎn)物于1.0 % 瓊脂糖凝膠上電泳,用BIO-RAD凝膠成像系統(tǒng)觀察、判別結(jié)果,擴(kuò)增出438 bp條帶的為陽性,未擴(kuò)增出438 bp條帶的為陰性。

5 甘蔗赤條病(red stripe)PCR檢測技術(shù)

5.1 DNA的提取

取0.2 g甘蔗葉片,加入液氮研磨成粉狀。采用DNA Kit植物DNA提取試劑盒提取葉片總DNA,具體步驟按照說明書操作,提取后用Eppendorf AG 22331蛋白/核酸分析儀鑒定DNA質(zhì)量。

5.2 擴(kuò)增甘蔗赤條病菌的特異性引物

引物序列采用文獻(xiàn)[13]報道的根據(jù)甘蔗赤條病菌[Xanthomonasrubrilineans(Leeetal.)StarretBurkh.]16S-23S rDNA基因間隔區(qū)保守序列設(shè)計的特異性引物,其序列為上游引物P0f:5′-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′;下游引物P6r:5′-CTACGGCAACCTTGTTACGA-3′,目的片段長度為1 500 bp。

5.3 PCR檢測

25 μL PCR擴(kuò)增體系中含ddH2O 11.0 μL、2×PCRTaq混合物12.5 μL、DNA模板1.0 μL、上、下游引物(10 μg/μL)各0.25 μL。PCR反應(yīng)程序為:95℃預(yù)變性5 min;95℃變性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸1 min,25個循環(huán);最后72℃延伸7 min。每個樣品進(jìn)行3次重復(fù)擴(kuò)增檢測。

5.4 結(jié)果及判別

取10 μL PCR 反應(yīng)產(chǎn)物于1.5 % 瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳,用BIO-RAD凝膠成像系統(tǒng)觀察、判別結(jié)果,擴(kuò)增出1 500 bp條帶的為陽性,未擴(kuò)增出1 500 bp條帶的為陰性。

6 甘蔗花葉病(SCMV, SrMV和SCSMV)RT-PCR檢測技術(shù)

6.1 甘蔗花葉病毒(Sugarcane mosaic virus, SCMV)RT-PCR檢測技術(shù)

6.1.1 RNA的提取

取新鮮葉片0.1 g于研缽中,加入液氮研磨成粉狀。采用RNA Kit植物RNA提取試劑盒提取葉片總RNA,具體步驟按照說明書操作,提取后用Eppendorf AG 22331蛋白/核酸分析儀鑒定RNA質(zhì)量。

6.1.2 擴(kuò)增SCMV的特異性引物

引物為本實驗室根據(jù)GenBank登錄的SCMV外殼蛋白(CP)基因保守序列設(shè)計的特異性引物,其序列為上游引物SCMV-F:5′-GATGCAGGVGCHCAAGGRGG-3′;下游引物SCMV-R:5′-GTGCTGCTGCACTCCCAACAG-3′,目的片段長度為924 bp。

6.1.3 RT-PCR檢測

用TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis Supermix試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄程序:10 μL RT體系中含2×TS reaction mix 5μL、DEPC水1.5 μL、0.5 μg/μL Oligod (T)180.5 μL、RT/RI enzyme mix 0.5 μL、gDNA remover 0.5 μL、RNA 2.0 μL;RT反應(yīng)條件是:25℃ 10 min,42℃ 30 min。PCR程序:20 μL PCR體系中含ddH2O 7.2 μL、2×PCRTaqmix 10 μL,cDNA模板2 μL,上、下游引物(20 μg/μL)各0.4 μL;PCR擴(kuò)增程序都為:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s,60℃退火30 s,72℃延伸1 min,35個循環(huán);72℃延伸10 min。每個樣品進(jìn)行3次重復(fù)擴(kuò)增檢測。

6.1.4 結(jié)果及判別

取10 μL PCR 反應(yīng)產(chǎn)物于1.0 % 瓊脂糖凝膠上電泳,用BIO-RAD凝膠成像系統(tǒng)觀察、判別結(jié)果,擴(kuò)增出924 bp條帶的為陽性,未擴(kuò)增出924 bp條帶的為陰性。

6.2 高粱花葉病毒(Sorghum mosaic virus,SrMV)RT-PCR檢測技術(shù)

6.2.1 RNA的提取

取新鮮葉片0.1 g于研缽中,加入液氮研磨成粉狀。采用RNA Kit植物RNA提取試劑盒提取葉片總RNA,具體步驟按照說明書操作,提取后用Eppendorf AG 22331蛋白/核酸分析儀鑒定RNA質(zhì)量。

6.2.2 擴(kuò)增SrMV的特異性引物

引物為本實驗室根據(jù)GenBank登錄的SrMV外殼蛋白(CP)基因保守序列設(shè)計的特異性引物,其序列為上游引物SrMV-F:5′-CATCARGCAGGRGGCGGYAC-3′;下游引物SrMV-R:5′-TTTCATCTGCATGTGGGCCTC-3′,目的片段長度為828 bp。

6.2.3 RT-PCR檢測

用TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis Supermix試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄程序:10 μL RT體系中含2×TS reaction mix 5 μL、DEPC水 1.5 μL、0.5 μg/μL Oligod (T)180.5 μL、RT/RI enzyme mix 0.5 μL、gDNA remover 0.5 μL、RNA 2.0 μL;RT反應(yīng)條件是:25℃ 10 min,42℃ 30 min。PCR程序:20 μL PCR體系中含ddH2O 7.2 μL、2×PCRTaqmix 10 μL,cDNA模板2 μL,上、下游引物(20 μg/μL)各0.4 μL;PCR擴(kuò)增程序都為:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s,60℃退火30 s,72℃延伸1 min,35個循環(huán);72℃延伸10 min。每個樣品進(jìn)行3次重復(fù)擴(kuò)增檢測。

6.2.4 結(jié)果及判別

取10 μL PCR 反應(yīng)產(chǎn)物于1.0 % 瓊脂糖凝膠上電泳,用BIO-RAD凝膠成像系統(tǒng)觀察、判別結(jié)果,擴(kuò)增出828 bp條帶的為陽性,未擴(kuò)增出828 bp條帶的為陰性。

6.3 甘蔗條紋花葉病毒(Sugarcane streak mosaic virus,SCSMV)RT-PCR檢測技術(shù)

6.3.1 RNA的提取

取新鮮葉片0.1 g于研缽中,加入液氮研磨成粉狀。采用RNA Kit植物RNA提取試劑盒提取葉片總RNA,具體步驟按照說明書操作,提取后用Eppendorf AG 22331蛋白/核酸分析儀鑒定RNA質(zhì)量。

6.3.2 擴(kuò)增SCSMV的特異性引物

引物為本實驗室根據(jù)GenBank登錄的SCSMV外殼蛋白(CP)基因保守序列設(shè)計的特異性引物,其序列為上游引物SCSMV-F:5′-ACAAGGAACGCAGCCACCT-3′;下游引物SCSMV-R:5′-ACTAAGCGGTCAGGCAAC-3′,目的片段長度為939 bp。

6.3.3 RT-PCR檢測

用TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis Supermix試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄程序:10 μL RT體系中含2×TS reaction mix 5 μL、DEPC水 1.5 μL、0.5 μg/μL Oligod (T)180.5 μL、RT/RI enzyme mix 0.5 μL、gDNA remover 0.5 μL、RNA 2.0 μL;RT反應(yīng)條件是:25℃ 10 min,42℃ 30 min。PCR程序:20 μL PCR體系中含ddH2O 9.6 μL、2×PCRTaqmix 8.0 μL,cDNA模板2 μL,上、下游引物(20 μg/μL)各0.2 μL;PCR擴(kuò)增程序為:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s,50℃退火30 s,72℃延伸1 min,35個循環(huán);72℃延伸10 min。每個樣品進(jìn)行3次重復(fù)擴(kuò)增檢測。

6.3.4 結(jié)果及判別

取10 μL PCR 反應(yīng)產(chǎn)物于1.0 % 瓊脂糖凝膠上電泳,用BIO-RAD凝膠成像系統(tǒng)觀察、判別結(jié)果,擴(kuò)增出939 bp條帶的為陽性,未擴(kuò)增出939 bp條帶的為陰性。

7 甘蔗斐濟(jì)病(Fiji disease)RT-PCR檢測技術(shù)

7.1 RNA的提取

取新鮮葉片0.1 g于研缽中,加入液氮研磨成粉狀。采用RNA Kit植物RNA提取試劑盒提取葉片總RNA,具體步驟按照說明書操作,提取后用Eppendorf AG 22331蛋白/核酸分析儀鑒定RNA質(zhì)量。

7.2 擴(kuò)增甘蔗斐濟(jì)病毒的特異性引物

引物采用文獻(xiàn)[13]報道的根據(jù)甘蔗斐濟(jì)病毒(Sugarcanefijidiseasevirus,SFDV)片段9(S9)基因組保守序列設(shè)計的特異性引物,其序列為上游引物FDV7F:5′-CCGAGTTACGGTCAGACTGTTCTT-3′;下游引物FDV7R:5′-CA GTGGTGACGAAAT GATGGCGA-3′,目標(biāo)片段長度為450 bp。

7.3 RT-PCR檢測

采用C.therm RT-PCR試劑盒進(jìn)行一步法RT-PCR檢測。于0.5 mL PCR管中加入1.0 μL RNA模板,上、下游引物(20 μg/μL)各0.25 μL,ddH2O 11.0 μL。將以上混合物在PCR儀上加熱至99℃變性2 min,然后立即置于冰上。在以上變性混合液中依序加入5×buffer 5 μL,10%PVP 2.5 μL,100 mmol/L DTT 1.25 μL,100%DMSO 1.25 μL,5% BSA 1.0 μL,20 mmol/L dNTPs 0.5 μL,C.therm酶 1.0 μL,反應(yīng)總體積為25 μL。PCR反應(yīng)條件為:57℃ 30 min;95℃ 2 min;95℃ 1 min,57℃ 1 min,72℃ 1 min,35循環(huán);72℃ 8 min。每個樣品進(jìn)行3次重復(fù)擴(kuò)增檢測。

7.4 結(jié)果及判別

取10 μL PCR 反應(yīng)產(chǎn)物于1.5 % 瓊脂糖凝膠上電泳,用BIO-RAD凝膠成像系統(tǒng)觀察、判別結(jié)果,擴(kuò)增出450 bp條帶的為陽性,未擴(kuò)增出450 bp條帶的為陰性。

8 甘蔗黃葉病毒(Sugarcane yellow leaf virus,ScYLV)RT-PCR檢測技術(shù)

8.1 RNA的提取

取新鮮葉片0.1 g于研缽中,加入液氮研磨成粉狀。采用RNA Kit植物RNA提取試劑盒提取葉片總RNA,具體步驟按照說明書操作,提取后用Eppendorf AG 22331蛋白/核酸分析儀鑒定RNA質(zhì)量。

8.2 擴(kuò)增ScYLV的特異性引物

引物為本實驗室根據(jù)GenBank登錄的ScYLV外殼蛋白(CP)基因保守序列設(shè)計的特異性引物,其序列為上游引物ScYLV-F:5′-AATCAGTGCACACATCCGAG-3′;下游引物 ScYLV-R:5′-GGAGCGTCGCCTACCTATT-3′,目的片段長度為634 bp。

8.3 RT-PCR檢測

采用One Step RNA PCR Kit(大連TaKaRa公司)進(jìn)行SCYLV CP基因RT-PCR擴(kuò)增。按序加入ddH2O 6.2 μL、PrimeScript 1 step enzyme mix 0.8 μL、2×1 step buffer 10.0 μL、上、下游引物(20 μmol/L)各0.5 μL、RNA模板2.0 μL于PCR管里,低速離心幾秒混勻后放入PCR儀。45℃ 30 min;94℃ 2 min;94℃ 30 s,52℃ 30 s,70℃ 1 min,30個循環(huán);70℃ 5 min。每個樣品進(jìn)行3次重復(fù)擴(kuò)增檢測。

8.4 結(jié)果及判別

取10 μL PCR 反應(yīng)產(chǎn)物于1.0% 瓊脂糖凝膠上電泳,用BIO-RAD凝膠成像系統(tǒng)觀察、判別結(jié)果,擴(kuò)增出634 bp條帶的為陽性,未擴(kuò)增出634 bp條帶的為陰性。

9 甘蔗桿狀病毒病(Sugarcane bacilliform virus,SCBV)PCR檢測技術(shù)

9.1 DNA的提取

取甘蔗葉組織0.3～0.5 g加適量液氮研磨至粉狀,轉(zhuǎn)至2 mL離心管中。采用DNA Kit植物DNA提取試劑盒提取葉片總DNA,具體步驟按照說明書操作,提取后用Eppendorf AG 22331蛋白/核酸分析儀鑒定DNA質(zhì)量。

9.2 擴(kuò)增SCBV的特異性引物

引物參照文獻(xiàn)[15]報道的根據(jù)SCBV基因組保守區(qū)域設(shè)計的特異性引物,其序列為上游引物PC1:5′-ACCAGATCCGAGATTACAGAAG-3′;下游引物PC2:5′-TCACCTTGCCAACCTTCATA-3′,目的片段長度為589 bp。

9.3 PCR檢測

在PCR管中按序加入ddH2O 7.6 μL、2×PCRTaqmix 10 μL、DNA模板2 μL、上、下游引物(20 μmol/L)各0.2 μL;加完后低速離心10 s后放進(jìn)PCR儀,94℃預(yù)變性2 min,94℃變性30 s,50℃退火30 s,72℃延伸1 min,30個循環(huán)后72℃延伸5 min。每個樣品進(jìn)行3次重復(fù)擴(kuò)增檢測。

9.4 結(jié)果及判別

取10 μL PCR 反應(yīng)產(chǎn)物于1.0% 瓊脂糖凝膠上電泳,用BIO-RAD凝膠成像系統(tǒng)觀察、判別結(jié)果,擴(kuò)增589 bp條帶的為陽性,未擴(kuò)增出589 bp條帶的為陰性。

10 甘蔗白葉病植原體(Sugarcane white leaf phytoplasma)巢式 PCR檢測技術(shù)

10.1 DNA的提取

取0.2 g甘蔗葉片,加入液氮研磨成粉狀。采用DNA Kit植物DNA提取試劑盒提取葉片總DNA,具體步驟按照說明書操作,提取后用Eppendorf AG 22331蛋白/核酸分析儀鑒定DNA質(zhì)量。

10.2 擴(kuò)增SCWL植原體的引物

引物采用文獻(xiàn)[16]報道的擴(kuò)增植原體16S rDNA基因的通用引物對P1/P7和R16F2n/ R16R2,其序列為P1:5′-AAGAGTTTGATCCTGGCTCAGGATT-3′,P7:5′-CGTCCTTCATCGGCTCTT-3′,目的片段長度為1 840 bp;R16F2n:5′-GAAACGACTGCTAAGACTGG-3′;R16R2:5′-TGACGGGCGGTGTGTACAAA CCCCG-3′,目的片段長度為1 240 bp。

10.3 巢氏PCR檢測

以P1/P7為引物進(jìn)行第1次PCR擴(kuò)增,PCR反應(yīng)體系為25 μL:總基因組DNA 1 μL,10×PCR buffer 2.5 μL,P1(20 μmol/L)1 μL,P7(20 μmol/L)1 μL,MgCl2(25 mmol/L)2.0 μL,dNTPs(10 mmol/L)2.0 μL,Taq酶(5 U/μL)0.2 μL,ddH2O 15.3 μL。第1次PCR擴(kuò)增程序為:94℃預(yù)變性3 min;94℃變性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸1 min,35個循環(huán);最后72℃延伸10 min。第2次PCR反應(yīng)體系25 μL:取1 μL第1次PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(稀釋30倍)作為模板DNA,R16F2n(20 μmol/L)1 μL,R16R2(20 μmol/L)1 μL,其他試劑用量同第1次PCR擴(kuò)增。第2次PCR擴(kuò)增程序為:94℃預(yù)變性3 min;94℃變性30 s,57℃退火30 s,72℃延伸1 min,35個循環(huán);最后72℃延伸10 min。每個樣品進(jìn)行3次重復(fù)擴(kuò)增檢測。

10.4 結(jié)果及判別

取10 μL PCR 反應(yīng)產(chǎn)物于1.0 % 瓊脂糖凝膠上電泳,用BIO-RAD凝膠成像系統(tǒng)觀察、判別結(jié)果,擴(kuò)增出1 240 bp條帶的為SCWL陽性,未擴(kuò)增出1 240 bp條帶的為陰性。

[1] 黃應(yīng)昆, 李文鳳. 現(xiàn)代甘蔗病蟲草害原色圖譜[M]. 北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社, 2011.

[2] 李文鳳, 王嘵燕, 黃應(yīng)昆, 等. 潛在的檢疫性甘蔗有害生物[J]. 植物保護(hù), 2010, 36(5): 174-178.

[3] 黃應(yīng)昆, 李文鳳, 盧文潔, 等. 云南蔗區(qū)甘蔗花葉病流行原因及控制對策[J]. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2007, 22(6): 935-938.

[4] 黃應(yīng)昆, 李文鳳, 趙俊, 等. 云南甘蔗宿根矮化病病原檢測[J]. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2007, 22(5): 762-765.

[5] 李文鳳, 黃應(yīng)昆, 姜冬梅,等. 云南甘蔗桿狀病毒的分子檢測及其對甘蔗品質(zhì)和產(chǎn)量的影響[J]．植物病理學(xué)報, 2010, 40(6): 651-654.

[6] 許東林, 李俊光, 周國輝. 廣東甘蔗黃葉病田間調(diào)查及病原病毒的分子檢測[J]. 植物病理學(xué)報, 2006, 36(5): 404-406.

[7] Wang Xaoyan, Li Wenfeng, Huang Yingkun, et al. Identification of sugarcane white leaf phytoplasma in fields and quarantine sugarcane samples in Yunnan Province, China [J]. Sugar Tech, 2015, 17(1): 85-88.

[8] 李文鳳, 黃應(yīng)昆. 現(xiàn)代甘蔗病害診斷檢測與防控技術(shù)[M]. 北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社, 2012.

[9] Singh N, Somai B M, Pillay D.Smut disease assessment by PCR and microscopy in inoculated tissue cultured sugarcane cultivars [J]. Plant Science, 2004, 167(5): 987-994.

[10]Glynna N C, Dixonb L J, Castleburyb L A, et al. PCR assays for the sugarcane rust pathogensPucciniakuehniiandP.melanocephalaand detection of a SNP associated with geographical distribution inP.kuehnii[J]. Plant Pathology, 2010, 59:703-711.

[11]Wang Z K, Comstock J C, Hatziloukas E, et al. Comparison of PCR Bio-PCR, DIA ELISA and isolation on semiselective medium for detection ofXanthomonasalbilineans, the causal agent of leaf scald of sugarcane [J]. Plant Pathology, 1999, 48: 245-252.

[12]Pan Y B, Grisbam M P, Buroer D M, et al. A polymerase chain reaction protocol for the detection ofClavibacterxylisubsp.xyli, the causal bacterium of sugarcane ratoon stunting disease [J]. Plant Disease, 1998, 82(3): 285-290.

[13]Paola D, Fontana A M, Rago C A, et al. Isolation and genetic characterization ofAcidovoraxavenaefrom red stripe infected sugarcane in Northwestern Argentina [J]. European Journal of Plant Pathology, 2013, 137:525-534.

[14]Smith G R, Vandevelde R.Detection of sugarcane mosaic virus and Fiji disease virus in diseased sugarcane using the polymerase chain reaction [J]. Plant Disease, 1994, 78(6): 557-561.

[15]蔡艷清,許東林,周國輝,等.廣東首次發(fā)現(xiàn)甘蔗桿狀病毒[M]∥彭友良.中國植物病理學(xué)會2004年學(xué)術(shù)年會論文集.北京:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社，2004:213-215.

[16]Gundersen D, Lee I M.Ultrasensitive detection of phytoplasmas by nested-PCR assays using two universal primer pairs[J]. Phytopathologia Mediterranea, 1996, 35: 144-151.

(責(zé)任編輯：田 喆)

Molecular detection techniques of sugarcane important diseases

Li Wenfeng, Wang Xiaoyan, Huang Yingkun, Shan Hongli, Zhang Rongyue, Yin Jiong, Luo Zhiming

(Sugarcane Research Institute, Yunnan Academy of Agricultural Sciences; Yunnan Province Key Laboratory of Sugarcane Genetic Improvement, Kaiyuan 661699, China)

Rapid and effective diagnosis detection for the pathogens of sugarcane important diseases and monitoring the pathogenic agents of the diseases are the foundation and key to scientific and effective controlling of sugarcane diseases. Through exploration research, improvement innovation and optimization, the rapid molecular detection techniques for 13 pathogens of 10 important diseases including sugarcane smut, rust, leaf scald, ratoon stunting, red stripe, mosaic, Fiji, yellow leaf, bacilliform virus and white leaf diseases were established by Sugarcane Research Institute, Yunnan Academy of Agricultural Sciences. These could provide scientific basis for effective diagnosis and controlling of sugarcane diseases, detection for virus-free healthy seedling and quarantine for introducing seeds.

sugarcane; important diseases; molecular detection

2015-10-26

2015-12-09

國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項資金(CARS-20-2-2)；云南省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項資金

S 435.661

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2016.05.021

* 通信作者 E-mail：huangyk64@163.com