我國植物免疫誘導技術的研究現狀與趨勢分析

邱德文

(中國農業科學院植物保護研究所, 北京 100193)

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我國植物免疫誘導技術的研究現狀與趨勢分析

邱德文

(中國農業科學院植物保護研究所, 北京 100193)

植物免疫誘導技術是近年來發展十分快速的新領域,本文從具有植物免疫誘導作用的蛋白質、殼寡糖和微生物誘導菌等方面介紹了我國植物免疫誘導技術的研究現狀,闡述了植物免疫誘導劑的作用機理及誘導和提高植物免疫抗病的作用,分析了植物免疫誘導劑蛋白質生物農藥、殼寡糖生物農藥及微生物誘抗劑的發展趨勢及應用前景。

植物免疫誘導劑; 蛋白質生物農藥; 殼寡糖

植物免疫誘導劑是指沒有直接的殺菌或抗病毒活性,但能夠誘導植物免疫系統使植物獲得或提高對病菌的抗性及抗逆性的藥物或其代謝產物。植物免疫誘導劑一般分為兩類：植物免疫誘導子(蛋白、寡糖、生物代謝產物或有機活性小分子)和植物免疫誘導菌(木霉菌、芽胞桿菌)。

植物免疫誘導子是指一類可以誘導寄主植物產生免疫抗性反應的活性分子,這種免疫抗性反應涉及植物生理生化、形態反應、植保素積累以及抗病基因表達等方面。誘導子從來源上可分為生物源和非生物源活性分子。生物源誘導子是指微生物、動、植物活體及其代謝產物,或寄主植物與病原菌互作產生的活性小分子,根據化學性質生物源誘導子可分為寡糖類誘導子、糖蛋白或糖肽類誘導子、蛋白類或多肽類誘導子以及脂類誘導子。這些誘導子通過與植物細胞表面的受體結合,激發植物的防御反應,使植物產生系統抗性。植物在生長過程中,會受到各種生物的和非生物的脅迫。為了生存和繁殖,植物必須對這些脅迫做出及時的和相應的反應。在植物受到病菌侵害時,過敏反應(hypersensitive response, HR)將被激活,造成病菌感染處的細胞死亡,從而能夠限制病菌的擴散和營養的流失。同時,植物還通過系統獲得抗性(SAR)的機制來保護自身。這種抗性遠離一級、二級免疫反應的位點,以便保護植物免于病原菌的再次攻擊。植物免疫所產生的信號傳導主要包括有水楊酸(SA)、茉莉酸(JA)、乙烯(ET)和脫落酸(ABA)途徑,調控植物抗病相關基因(resistance gene, R-gene)的表達,能夠有效地防御大部分病原菌[1]。由于植物免疫代謝過程是由一個網絡系統進行調控的,在這個網絡調控中,植物抗性和植物生長的代謝也有交互影響,由此可見,在植物免疫誘導的過程中,除了抗性反應外,植物還會根據脅迫的種類和程度,主動調節自己的生理進程,包括發育和開花等。

1 我國植物免疫誘導技術的研究現狀

1.1 具有植物免疫誘導作用蛋白質的研究現狀

我國在蛋白質類植物免疫誘導劑的研究領域目前已處于國際領先水平,通過對微生物源蛋白誘導子的篩選、分離純化、基因克隆與表達、蛋白質結構與功能研究,創建了“蛋白-基因-蛋白”的植物免疫誘導蛋白發掘技術平臺。獲得了10個有自主知識產權的免疫誘抗蛋白及基因克隆。“蛋白-基因-蛋白”篩選模式是以誘導植物提高免疫抗性為指標,從微生物發酵代謝產物中直接分離純化天然目的蛋白,通過生物質譜技術和分子克隆技術獲得蛋白的氨基酸序列和基因序列,進而獲得表達蛋白,再檢驗表達蛋白與天然蛋白的誘抗活性是否一致。當前國際上通常采用的是從基因文庫中通過基因表達篩選獲得功能蛋白,經這一技術獲得的功能蛋白只是蛋白質片段,完整蛋白的獲得需要從基因文庫中反復調取。而“蛋白-基因-蛋白”的創新模式克服了從基因文庫反復調取基因片段不斷拼接反復驗證的多批次篩選的繁雜過程,從而加速了蛋白藥物的篩選進程。該技術路線得到的靶標蛋白功能更明確,有利于直接篩選到具有生物活性的完整蛋白。目前,應用該創新篩選模式,已分別從極細鏈格孢(Alternariatenuissima)、稻瘟病菌(Magnaportheoryzae)、大麗輪枝菌(Verticilliumdahliae)、灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea)等病原真菌以及側孢短芽胞桿菌(Brevibacilluslaterosporus)、解淀粉芽胞桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)等生防細菌中分離獲得了PeaT1、Hrip1、MoHrip1、MoHrip2、PemG1、PevD1、BcGS1、PebC1、PeBL1、PeBA1等10個植物免疫誘抗蛋白,為后續免疫蛋白質農藥的開發積累了大量的蛋白資源。

創立了多功能、多指標的誘抗蛋白評價技術體系。通過對蛋白誘導子作用機理的研究,明確了蛋白誘導植物抗病和促生長的分子基礎及信號轉導途徑[2-3]，確定了誘抗蛋白在煙草細胞膜上的蛋白結合位點[4];通過激活植物早期防御信號(pH上升、H2O2、NO)產生、誘導蛋白激酶以及防衛基因和蛋白的上調表達,最終使植物產生系統抗性[5-7]。基于免疫蛋白作用機制的研究,在誘抗蛋白評價體系中,創立了過敏性檢測、TMV抗性、氧爆發、防衛基因上調表達、NO產生、細胞外液pH變化、植物促生長等多功能、多指標的誘抗蛋白評價技術體系。

我國已經自主研發了高效、低成本的免疫誘抗蛋白膠體磨剪切規模化生產新工藝,建立了年產能力800 t/年的蛋白質農藥生產線。極細鏈格孢菌產生的免疫蛋白具有良好的誘導植物免疫抗性和促進植物生長的功能[2,8-12]。通過對極細鏈格孢菌天然菌株三級發酵工藝(培養基組分及比例、溫度、pH、溶氧量等)的研究、免疫誘抗蛋白高效規模化生產工藝的優化(參數調整、各發酵階段補料節點的確定等),使誘抗蛋白產率由原來的1.337 g/L提高到5.17 g/L,提高近4倍[13];通過發酵后處理、蛋白提取工藝及制劑加工工藝研究,建立了免疫誘抗蛋白制劑生產工藝。在后處理工藝中創建了膠體磨提取蛋白質的生產工藝(目前全球提取蛋白質工藝主要有超聲波技術、高壓細胞破碎技術和離心分離技術等),蛋白提取效率大幅度提高。根據植物多重免疫理論,在發酵液后處理過程中,保留了代謝物中的寡糖和多肽等增效成分,同時通過添加蛋白保護劑和科學配伍與優化,自主研發形成了高效低成本的免疫誘抗蛋白規模化生產線。在河南省安陽市湯陰高新區建立了國內首個三級發酵的蛋白質生產基地,該基地占地36 000 m2,生產車間3 000 m2,年產能力達到800 t/年。

1.2 新型糖類(殼寡糖)免疫誘導劑的研究現狀

寡糖類植物免疫誘導劑在我國已有多年的研究與產業化基礎,天然的殼寡糖、海藻糖等具有很好的誘導植物免疫、提高農作物抗病性的作用,植物與病原菌互作過程中釋放的細胞壁寡糖片段具有誘導植物免疫系統、誘導植物抗病的功效,可開發為新型農用制劑。對此類誘導劑的研究與開發也成為當前國際植保學界的研究熱點,相關產品也隨之出現。殼聚糖存在于某些病原菌的細胞壁上,在植物與病原菌互作過程中,其降解產生的糖類片段可調控植物免疫產生抗性。殼聚糖具有原料廣泛、易于降解等特點,因此目前已有大量以殼聚糖及其衍生物為原料的產品出現,如我國研發了殼聚糖生物制劑及其與免疫蛋白的復配農藥制劑;殼聚糖已被韓國農林部認證為親環境農作物生產的活性劑。到目前為止,已登錄認證的殼聚糖及殼寡糖農業制劑產品共31件。我國目前已登記的糖類免疫誘導劑生物農藥有80余項,但有效成分也多為殼寡糖。

實際上,除幾丁質與殼聚糖外,在植物與病原菌相互作用過程中,植物與病原菌細胞壁還存在大量其他多糖,如植物細胞壁果膠多糖、真菌細胞壁葡聚糖等。國內外對于果膠及其降解產物寡聚半乳糖醛酸、真菌細胞壁多糖及其降解產物的活性已有一些報道,已明確了它們在植物上具有高效誘抗活性,寡聚半乳糖醛酸的作用機制也較為明確。但由于這些細胞壁糖類結構復雜,其清潔化生產工藝的缺乏、成本及應用技術等方面的問題,限制了這類產品的開發及相關產業的發展。

中國科學院大連化學物理研究所在寡糖農用制劑創制及應用推廣方面有良好研究基礎,從“十五”以來連續承擔殼寡糖生物制備及其應用的多項科技項目,經多年研究積累已奠定雄厚的研究開發基礎和隊伍,在多糖降解酶創制、寡糖誘導植物免疫作用機制等方向上部分成果達到國際領先水平,累計發表研究論文200余篇,申請專利70余項,獲海洋科技進步獎及遼寧省科技進步獎等獎勵多項,被國內同行認為是國內寡糖制備技術及產品研發具有領先優勢的科研機構。

研究團隊以殼寡糖為原料,研制出多個寡糖植物免疫誘導劑及復配制劑,已獲國家農藥登記證11個,實現產業化并已在農業生產中推廣335萬hm2,在提高農作物產量和品質方面發揮了較大作用。研究團隊在糖苷酶的創制和多糖可控降解方面具有多年的研究經驗,前期通過對多種來源的產酶菌株進行篩選,再利用基因工程的改造方法,已成功創制了高活性、高專一性的糖苷水解酶數十種,結合生物化工方法,成功實現殼聚糖的可控降解及殼寡糖的大規模生產制備。進一步建立了糖類植物免疫誘導劑的活性篩選技術平臺并深入進行了作用機制研究,提出了“糖鏈植物疫苗”概念,建立了殼寡糖針對不同作物的應用技術[14]。這些前期研究過程中建立的糖苷酶篩選改造平臺、寡糖可控制備及分析檢測技術平臺、誘抗活性篩選平臺等都為新型細胞壁寡糖免疫誘導劑的研究與開發提供了堅實的基礎。

1.3 微生物誘抗菌的研究現狀

微生物誘抗菌是指本身或其代謝產物能夠激發植物自身免疫系統從而使植物獲得抗病及抗逆性能的微生物,屬于生物源誘導菌。其中,木霉菌是國際開發和應用歷史悠久的生物防治微生物,分布極為廣泛。木霉菌是廣泛存在于土壤中的有益微生物,其在全球已有多年的研究與應用歷史,在我國也已有多個生產廠家登記注冊和產品推廣應用。近年來,隨著植物免疫誘導抗性研究的快速發展,我國上海交通大學科研團隊研究證實, 木霉菌自身及其代謝產物均具有誘導植物免疫提高農作物抗性的作用,其生長過程中分泌絲氨酸蛋白酶、22 kD木聚糖酶、幾丁質脫乙酰基酶、幾丁質酶Chit42、SnodProt1蛋白(SnodProt1、Sm1和EPI)、脂肽、棒曲霉素類蛋白、無毒基因蛋白等，從而具有明顯的增強植物免疫力和促進植物生長的功能[15]。生物源誘導菌如木霉菌和枯草芽胞桿菌等均可誘導植物發生MTI(microbe trigger immunity)反應,而一些專化性誘導子具有無毒基因(avr)的功能,可與植物的抗性基因(R)特異互作,誘導植物產生免疫反應,即一種ETI(effector trigger-immunity)反應。由此可見,木霉和枯草芽胞桿菌等是一類具有廣泛應用前景的生物源誘導菌。

生物源誘導菌-木霉主要是來自5個木霉菌種：綠木霉(Trichodermavirens)、綠色木霉(T.viride)、哈茨木霉(T.harzianum)、棘孢木霉(T.asperellum)和深綠木霉(T.aureoviride)。Sm1/EPl1是木霉菌中的典型生物源誘導子,這2種誘導子均屬于cerato-palanin(CP)家族成員。研究表明,Sm1晶體結構具有Φ-β-桶狀折疊,木霉菌可通過這一結構域識別植物或真菌細胞壁寡糖,從而誘導植物產生免疫反應提高植物抗病性。木霉菌作為生物源誘導菌也與誘導子一樣所誘導的植物免疫為系統獲得抗性(SAR)。生物源誘導菌綠木霉所分泌的Sm1主要是單體具有誘導植物免疫的活性,EPl1是二聚體無植物免疫誘導活性。

近年來,我國關于木霉菌源蛋白農藥相關研究主要集中在上海交通大學、浙江大學、哈爾濱工業大學、山東省科學院等單位。上海交通大學采用木霉菌突變株構建、蛋白活性分析、編碼蛋白基因功能分析、蛋白互作、蛋白質組與轉錄組分析等方法獲得多個具有誘導抗性功能的誘導子蛋白,明確了作用機理。如Sm1、纖維素酶蛋白、疏水蛋白等,對玉米免疫系統和防御反應酶系具有系統的誘導作用[16]。浙江大學研究了4個木霉菌株產木聚糖酶的條件,并以水稻紋枯病為病害系統,研究木霉菌株NF9及其木聚糖酶的誘導抗性[17]。主要研究結果如下: (1)4個生防木霉菌株NF9、P1、CT22、TC3產木聚糖酶的條件;(2)生防木霉NF9孢子懸浮液及其木聚糖酶粗提液均誘導水稻對紋枯病的抗性;(3)兩種濃度(106個/mL和107個/mL)孢子懸浮液處理,誘導抗性無顯著差異;(4)木霉NF9處理的干重與根冠比均高于對照,干重與根冠比分別比對照提高了12.1%和32.4%,而木霉NF9的木聚糖酶粗提液處理的水稻的干重、根冠比與對照差異不顯著。東北林業大學研究了生防菌棘孢木霉(Trichodermaasperellum)T4菌株小分子疏水蛋白hyb2的功能,克隆獲得hyb2的全長cDNA和DNA序列,克隆獲得的棘孢木霉小分子疏水蛋白hyb2 結構是由2 個鄰近的β-發夾組成的核心β-桶和1 個α-螺旋組成,這個與上述疏水蛋白結構一致。通過分析,確定了克隆棘孢木霉的hyb2屬于Ⅱ型疏水蛋白[18]。青島農業大學通過基因重組技術獲得了原核表達較高活性的幾丁質酶蛋白[19]。哈爾濱工業大學分別構建了棘孢木霉T4和球毛殼菌(Chaetomiumglobosum)W7菌絲體的cDNA文庫[20]。

2 我國植物免疫誘導劑的發展趨勢和前景分析

近年來,植物免疫誘抗劑的研發與應用使植物病蟲害的綠色防控又有了新的突破。利用免疫誘導技術提高植物自身抗性,是有害生物綠色防控的新技術和新方法,能大幅度減輕病蟲害發生,減少或免用化學農藥,是解決環境污染、農產品安全、實現農藥零增長的有效途徑,成為作物健康解決方案的重要基礎,在作物病蟲害綜合防治以及增產增收計劃中發揮越來越重要的作用。隨著全民對食品安全、糧食安全和環境安全問題的逐漸重視以及政府對化學農藥的限制使用政策,免疫誘抗劑不僅在糧食作物、果蔬等作物病蟲害綜合防控中的需求逐漸增大,而且廣大用戶的接受程度也在不斷增強,由此帶動了免疫誘抗劑產業的迅速發展。

植物激活劑能刺激植物自身系統獲得抗病性能,是今后植物保護的新方向和新領域,商品化的植物激活劑有苯并噻二唑(BTH)、噻酰菌胺(TDL)、2,6-二氯異煙酸(INA)、N-氰甲基-2-氯異煙酰胺(NCI)、烯丙異噻唑(probenazole)、茉莉酸甲酯(MeJA)、異噻菌胺(isotianil)等[21-22]。Yoshioka等[23]合成了含有BTH陽離子結合陰離子的新鹽衍生物改變了所得產物的物理性質和抗菌性能,同時保留了系統獲得抗病性的誘導性能。該藥劑由于生產成本高昂而未能在全球普及。噻酰菌胺(TDL)是稻瘟病防治藥劑,能誘導煙草植株抗性基因的表達[24],并能代謝產生具有誘導抗病活性的4-甲基-1,2,3-噻二唑-5-甲酸[25]。異噻菌胺可激發水稻的天然防御機制防治稻瘟病[26]。這兩個品種僅在日本應用較多,在其他地區應用受到種植結構等因素的限制。此外,美國生物農藥公司(Marrone Bio Innovation, MBI)的虎杖提取物也具有很好的誘導抗病活性,該藥劑目前由先正達在全球銷售。

作為一類新型的多功能生物農藥,已有部分產品(如蛋白誘導子、寡糖、脫落酸、枯草芽胞桿菌及木霉菌等)分別以植物免疫誘導劑蛋白質生物農藥、殼寡糖生物農藥及微生物誘抗劑等,在國內管理部門登記注冊,并得到大面積的推廣應用。這些免疫誘抗藥物的共同突出特點是它們不同于傳統的殺菌劑,并不直接殺死病原菌,而是通過調節植物的新陳代謝,誘導植物自身的免疫系統和生長系統,增強植物產生廣譜性的抗病、抗逆能力。由中國農業科學院植物保護研究所根據植物免疫誘導技術最新研究成果開發出來的全球第一個抗植物病毒病蛋白質生物農藥6%寡糖鏈蛋白可濕性粉劑(商品名稱:阿泰靈),2014年獲得農藥登記證上市以來,受到了廣大農戶的好評, 經田間試驗示范表明：該藥對農作物病毒病的防控效果達70%以上,優于市場上現有的抗病毒劑藥物的效果(30%～40%);提高糧食作物、蔬菜、水果和茶葉產量10%以上。植物免疫誘抗劑農藥的研發正在成為當今國際新型生物農藥的重要發展方向,并將迅速成為具有巨大發展前景的新型戰略產業。該領域的研究將對國際植物保護重大基礎理論研究做出重要貢獻,大大提升我國在植物免疫領域的地位和實力,對我國農業的可持續發展、生態環境保護、糧食和食品安全具有十分重要的意義。

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(責任編輯：田 喆)

Research status and trend analysis of plant immune induction technology in China

Qiu Dewen

(Institute of Plant Protection, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193, China)

Plant immune induction technique is a new research field with rapid development in recent years. This paper introduced the research status of plant immune induction technology in China from the aspects of immune induced protein, chitosan oligosaccharide and microbial biopesticide. The action mechanism of the plant immune induction agent and the function of inducing and enhancing the plant immune resistance against plant diseases were expounded, and the development trend and application prospect of protein bio-pesticide, chitosan-oligosaccharide and microbial induced resistance agent were also analyzed in this review.

plant immune inducer; protein biological pesticide; chitosan-oligosaccharide

2016-08-19

2016-08-25

國家自然科學基金(31371984)

S 482.899

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2016.05.002

聯系方式 E-mail:qiudewen@caas.cn