人乳頭瘤病毒HPV E6/E7mRNA檢測用于宮頸癌術(shù)后隨訪的研究

方 戀，樊利芳，肖鳳儀

（1.武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，湖北 武漢 430060；2.湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬隨州醫(yī)院婦產(chǎn)科，湖北 隨州 441300）

宮頸癌（Cervical cancer）是目前全世界范圍內(nèi)，婦女所患最常見的惡性腫瘤之一。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明高危型人乳頭狀病毒（HPV）的感染是婦女罹患宮頸病變及宮頸癌發(fā)生的重要因素[1]，其主要致病機(jī)制是位于HPV內(nèi)部的E6/E7癌基因表達(dá)產(chǎn)生E6/E7癌蛋白，E6蛋白抑制p53而阻斷凋亡，E7蛋白抑制pRB使細(xì)胞周期失控，致使細(xì)胞癌變的發(fā)生。而HPV E6/E7mRNA是E6/E7癌基因表達(dá)活動的直接產(chǎn)物，也是E6/E7癌蛋白合成的模板，是宮頸病變開始和進(jìn)展的必要條件。因此，HPV E6/E7 mRNA檢測是繼HPV DNA檢測之后的新一代宮頸病變評估方法，且通過對病毒癌基因的活動狀態(tài)的檢測來評估宮頸病變的風(fēng)險程度，可能具有更高的特異性和陽性預(yù)測值。本研究對我院120例宮頸癌術(shù)后患者術(shù)后3個月內(nèi)取脫落細(xì)胞行HPV E6/E7 mRNA的檢測，并進(jìn)行了為期18個月的隨訪跟蹤，以探討HPV E6/E7 mRNA檢測在宮頸癌術(shù)后隨訪及評估復(fù)發(fā)風(fēng)險的臨床應(yīng)用價值及優(yōu)勢。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取我院2014年3月～2015年9月的120例已行宮頸癌手術(shù)且病理確診為宮頸病變的患者。病例納入標(biāo)準(zhǔn)：1）患者均符合術(shù)后復(fù)檢標(biāo)準(zhǔn)，即術(shù)后3個月對其復(fù)診時采集陰道脫落細(xì)胞；2）年齡在36～69歲；3）排除在3天內(nèi)有陰道給藥或陰道沖洗者；4）無內(nèi)科免疫系統(tǒng)疾病及使用相關(guān)藥物史；5）無化療及盆腔放療史；6）初次術(shù)后切緣陰性；7）對于以上各組研究對象的臨床年齡、體重等一般指標(biāo)進(jìn)行對比統(tǒng)計(jì)分析后發(fā)現(xiàn)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。且在觀察范圍內(nèi)的所有對象均給予簽署相關(guān)知情同意書。8）臨床隨訪資料完整。

1.2 方法

1.2.1 HPV E6/E7 mRNA拷貝數(shù)測定

使用專用刷在陰道殘端逆時針旋轉(zhuǎn)3圈，停留10 s，將得到的標(biāo)本置于標(biāo)本保存管中。采用分支鏈DNA（b-DNA)擴(kuò)增技術(shù)對HPV E6/E7 mRNA進(jìn)行檢測,使用儀器試劑為科蒂亞生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的QuantiVirusTM冷光儀和HPV E6/E7 mRNA檢測試劑盒。嚴(yán)格遵循試劑盒說明進(jìn)行操作，以拷貝數(shù)＜ 1copy/ml 為陰性，≥1copy/ml 為陽性。

1.2.2 薄層液基細(xì)胞學(xué)檢（TCT）

用TCT專用毛刷收集陰道殘端的脫落細(xì)胞，按照國際癌癥協(xié)會推薦的伯塞斯達(dá)系統(tǒng)（TBS）（2001）分類標(biāo)準(zhǔn)染色分類。

1.2.3 陰道鏡檢查及宮頸活檢

由專職陰道鏡醫(yī)師用電子陰道鏡觀察，并于醋酸白試驗(yàn)和碘試驗(yàn)異常區(qū)行選擇性多點(diǎn)組織檢查（活檢）或取陰道殘端3,6,9,12點(diǎn)行常規(guī)活檢。

1.2.4 隨訪檢測

于術(shù)后3個月內(nèi)進(jìn)行HPV E6/E7 mRNA的檢測，按檢測結(jié)果分陰性及陽性組，并于術(shù)后6個月、12個月、18個月三時間點(diǎn)進(jìn)行隨訪檢測，行薄層液基細(xì)胞學(xué)檢測（TCT）及陰道鏡檢查，陰道鏡檢陽性患者行組織病理活檢。

1.2.5 復(fù)發(fā)判斷標(biāo)準(zhǔn)

術(shù)后隨訪陰道殘端病理診斷發(fā)現(xiàn)HPV E6/E7 mRNA檢測陽性判斷為復(fù)發(fā)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，按照1.2.5所述復(fù)發(fā)判斷標(biāo)準(zhǔn)版，計(jì)算HPV E6/E7 mRNA檢測的敏感性 特異性陽性預(yù)測值 陰性預(yù)測值 和預(yù)測復(fù)發(fā)正確率。采用x2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

術(shù)后6、12、18個月的隨訪檢測時累計(jì)發(fā)現(xiàn)病灶復(fù)發(fā)共計(jì)21例，殘留/復(fù)發(fā)比例為17.5%（21/120）。

術(shù)后進(jìn)行HPV E6/E7 檢測的120名受試者有20名檢測結(jié)果為陽性，此120名宮頸癌患者術(shù)后12個月后共有21人出現(xiàn)殘留/復(fù)發(fā)。其預(yù)測率為95.23%（20/21）。

表1 120例宮頸癌患者隨訪前基本情況

表2 120例患者術(shù)后18個月累計(jì)隨訪檢測結(jié)果

表3 E6E7mRNA 檢測對術(shù)后預(yù)測殘留/復(fù)發(fā)的診斷價值

3 討 論

宮頸癌是現(xiàn)代女性生活危害婦女生命健康的一大疾患，現(xiàn)已升為婦科腫瘤第二大疾病，而感染HPV是公認(rèn)的宮頸癌患者發(fā)病的重要原因。罹患宮頸癌（I-Ⅱa期）患者早期治療以手術(shù)為主，其術(shù)后5年存活率較高，可達(dá)100%，但仍有部分患者出現(xiàn)術(shù)后復(fù)發(fā)的可能。而早期檢查與早期手術(shù)干預(yù),則極大地提高了宮頸癌患者的愈后,但是對于晚期以及術(shù)后復(fù)發(fā)的患者的治療仍十分棘手。復(fù)發(fā)往往發(fā)生在具有高危因素的患者：如盆腔內(nèi)有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、宮頸局部病變超過4cm者均為復(fù)發(fā)相關(guān)因素，且初次手術(shù)治療后,患者是否會出現(xiàn)復(fù)發(fā)、什么時候復(fù)發(fā)以及復(fù)發(fā)部位均難以預(yù)測，誤診及臨床分期不準(zhǔn)確或許是其復(fù)發(fā)的原因之一。宮頸癌是目前治療效果相對較好的婦科腫瘤，通常臨床醫(yī)師認(rèn)為Ⅱa期以前的病例最好采取手術(shù)治療，但臨床上常發(fā)生不規(guī)范的手術(shù)治療，如術(shù)前診斷不準(zhǔn)確、臨床分期不準(zhǔn)確，使手術(shù)范圍過小，從而導(dǎo)致術(shù)后復(fù)發(fā)。除上述因素外，宮頸癌預(yù)后差的原因還包括：患者年齡≦35歲、臨床分期晚、原發(fā)腫瘤≧4cm，腫瘤的組織學(xué)類型不良及子宮頸深間質(zhì)侵犯、淋巴毛細(xì)血管受侵、盆腔和腹主動脈旁淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、宮旁組織受侵、陰道切緣陽性和子宮內(nèi)膜受侵等因素。因此，有學(xué)者提出對早期宮頸癌患者，單一外科治療不能使其生存期最大限度延長，為了提高療效，必須對有復(fù)發(fā)危險因素的患者進(jìn)行綜合治療，即新輔助化療（NAC）和術(shù)后同步放化療。但由于放化療均有較大的副作用，如何評估宮頸癌術(shù)后患者的復(fù)發(fā)風(fēng)險，篩選出須要接受術(shù)后同步放化療的高風(fēng)險患者就顯得尤為重要。

目前常用的術(shù)后隨訪監(jiān)測是通過HPV DNA檢測，細(xì)胞學(xué)檢測，陰道鏡檢測和組織病理活檢。其中細(xì)胞學(xué)檢測，陰道鏡檢測和組織病理活檢只有當(dāng)癌變已經(jīng)發(fā)生后檢測出來，無法作為預(yù)測術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險的指標(biāo)。HPV DNA檢測通過檢測病毒本身的存在評估宮頸病變，雖然具有較高的敏感性，但特異性相對較低，可檢出過多的無臨床意義感染（如一過性感染）。宮頸癌的關(guān)鍵病因是HPV E6/E7癌基因表達(dá)產(chǎn)生E6/E7癌蛋白（真正的致癌物質(zhì)）。HPV E6/E7 mRNA是E6/E7癌基因表達(dá)活動的直接產(chǎn)物，也是E6/E7癌蛋白合成的模板，是宮頸癌變開始和進(jìn)展的必要條件。持續(xù)性整合感染才會產(chǎn)生較多的E6/E7 mRNA, 進(jìn)而產(chǎn)生較多的E6/E7癌蛋白，從而導(dǎo)致宮頸癌。HPV E6/E7 mRNA檢測通過檢測病毒致癌基因表達(dá)產(chǎn)生致E6/E7癌蛋白的活動及活動程度，評估宮頸術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險，具有更高的特異性和陽性預(yù)測值。

HPV是一類亞型種類繁多，可感染陰道上皮鱗狀細(xì)胞的雙鏈DNA病毒。其中已確認(rèn)特異HPV亞型的感染與肛門、生殖器鱗癌的發(fā)生有關(guān)，包括外陰、陰道、肛門、陰莖及頭頸部癌[2-7]。大部感染者均能夠自愈，但仍有部分人可持續(xù)存在，且最后發(fā)展為不同分型的宮頸病變，而高致病性的主要由高危HPVs所致[8]。

有研究表明[9]99.7%的宮頸癌患者的病變組織中都存在有HPV的感染，其陽性說明已有HPV的感染，但并不代表其已致癌變，只有反復(fù)感染或持續(xù)感染的患者才會進(jìn)展[10]，這種感染人群機(jī)率很低，少于10%；這說明HPV DNA的檢測可能會檢測出較多無臨床意義的感染，而對于識別HPV DNA是否存在有持續(xù)感染則顯得成尤為重要；HPV E6/E7 mRNA的檢測是對HPV DNA檢測缺陷的彌補(bǔ)，因其檢測的指標(biāo)為宮頸細(xì)胞病變程度相關(guān)的病毒活動，因此HPV E6/E7 mRNA檢測技術(shù)是近年來國際上最新推出的新一代檢測靶標(biāo)，其不僅對高危型HPV持續(xù)性感染的婦女有診斷價值，對于已行宮頸癌術(shù)后的患者同時也具有很高、很精準(zhǔn)的臨床診斷價值。Sotlar K等的研究表明，與HPV DNA檢測相比，E6/E7 mRNA檢測作為判斷HPV與病變進(jìn)展為宮頸癌的風(fēng)險相關(guān)性的指標(biāo)更有效[11]。

本研究中通過對120例宮頸癌術(shù)后的患者進(jìn)行HPV E6/E7 mRNA方法檢測，并在共計(jì)18個月的隨訪期間行TCT檢測和陰道鏡檢測，陰道鏡檢陽性患者行組織病理活檢。結(jié)果顯示術(shù)后3個月內(nèi)檢測HPV E6/E7 mRNA陽性患者全部在18個月內(nèi)出現(xiàn)殘留/復(fù)發(fā)病灶，而術(shù)后E6/E7 mRNA陰性患者僅有1%（1/100）出現(xiàn)殘留/復(fù)發(fā)病灶。對于預(yù)測術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險，HPV E6/E7mRNA檢測顯示出非常高的特異度與陽性預(yù)測值，這一點(diǎn)與國外Benevolo[12]的研究結(jié)果也是相符的。此外，本研究隨訪期內(nèi)同時進(jìn)行了3次液基細(xì)胞學(xué)檢測，但是仍有3例（2.5%）TCT結(jié)果陰性的患者活檢證實(shí)出現(xiàn)病灶殘留/復(fù)發(fā)，這3例患者E6/E7 mRNA檢測均為陽性。另一方面，本研究中唯一1例E6/E7陰性活檢出現(xiàn)復(fù)發(fā)患者 TCT結(jié)果為陽性，說明如果將TCT與HPV E6/E7 mRNA檢測聯(lián)合則可能更好的避免出現(xiàn)漏診。

綜上所述，筆者認(rèn)為HPV E6/E7 mRNA能夠用于評估宮頸癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險，臨床上建議針對術(shù)后E6/E7mRNA陽性患者加強(qiáng)隨訪監(jiān)控，可嘗試早期聯(lián)合放化療治療方案積極地采取措施，以期降低宮頸癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)率，并及時對于出現(xiàn)復(fù)發(fā)病灶患者進(jìn)行治療。

[1] Sn-ders PJ,Heideman DA,Meijer CJ.Methodsfor HPV de-tection in exfoliated cell and tissuepecimens.APMIS,2010,118(6～7):520-528.

[2] HILLBERTZ NS,HIRSCH JM,JALOULI J,etal.Viral and molecular aspects of oral cancel[J].Anticancer Res,2012,32(10):4201-4212.

[3] 孫 遠(yuǎn),徐衛(wèi)國.HPV與肛門腫瘤[J].國際腫瘤學(xué)雜志,2010,37(7):544-547.

[4] JOSEPH AW,D′SOUZA G.Epidemiology of human papillomavirus-related head and neck cancer[J].Otolaryngol Clin North Am,2012,45(4):739-764.

[5] SEHNAL B,DRIAK D,NEUMANNOVA H,et al.Prevalence of anal human papillomma virus infection among women and its relation to cervical HPV infection [J].Cseka Gynekol,2012,77(3):210-214.

[6] BIRCH-JOHANSEN F,NORRILD B,OLESEN A B,et at.HPV infection might play a role in the development of nonmelanoma skin cancer in immunocompetent indivdduals[J].Ugeskr Laeger,2012,174(7):413-417.

[7] 李 海,鄧志勇,張 陽.人乳頭瘤病毒在陰莖鱗癌組織中的表達(dá)及意義[J].現(xiàn)代實(shí)用醫(yī)學(xué),2010,22(9):1037-1038.

[8] STANLEN M.Pathology and epidemiology of HPV infection in females [J].gynecol Oncol,2010,117(2):5-10.

[9] 任美英,王翠峰,付玉華.HPV E6/E7 mRNA定量檢測技術(shù)及其在宮頸病變中的臨床應(yīng)用,世界最新醫(yī)學(xué)信息文摘(電子版),2012,12(9):50.

[10] 趙倩穎,鄭明蓉.高危型人乳頭瘤病毒E6/E7 mRNA檢測篩檢宮頸癌的價值.中國實(shí)用婦科與產(chǎn)科雜志,2013,29(10):837-840.

[11] Sotlar K,Selinka HC,Menton M,et al.Detection of human papillomavirus type 16 E6/E7 oncogene transcripts in dysplastic and nondysplastic cervical scrapes by nested RT-PCR. Gynecologic oncology,1998,69(2):114-121.

[12] Benevolo M, Vocaturo A, Caraceni D,et al. Sensitivity, Specificity and clinical value of human papillomavirus(HPV) E6/E7 mRNA assay as a triage test for cervical cytology and HPV DNA test [J].Clin Microbiol,2011,49(7):2643-2650.