高糖通過下調miR-23b促進血管平滑肌細胞的增殖和遷移

易志剛郭文安吳 娟黃上萌李 津池清華

高糖通過下調miR-23b促進血管平滑肌細胞的增殖和遷移

易志剛1郭文安1吳 娟1黃上萌1李 津1池清華2

目的高糖誘導血管平滑肌的增殖和遷移是糖尿病引起動脈粥樣硬化的關鍵病理環節。小分子RNA在糖尿病血管并發癥中的作用日益受到重視，本項目將對微小RNA-23b（miR-23b）在高糖誘導血管平滑肌的增殖和遷移中的作用進行研究。方法首先，將血管平滑肌細胞株（VSMCs）與高糖（HG，40 mM）共同孵育24 h，qPCR檢測高糖對VSMCs 增殖及miR-23b的表達的影響。為了進一步證實miR-23b在高糖誘導VSMC增殖及遷移中的作用，轉染過表達miR-23b載體及對照載體，構建過表達 VSMCs（VSMCmiR-23b）及對照細胞（VSMCNC），將HG分別與VSMCmiR-23b及VSMCNC孵育24 h，CCK-8檢測VSMCs的增殖，Transwell檢測VSMCs遷移，qPCR檢測miR-23b及其靶基因的PI3KR1、Smad3表達。結果HG能濃度依賴性的促進VSMCs的增殖并抑制miR-23b的表達，與對照組比較差異均有統計學意義（P＜0.05）。VSMCmiR-23b組的細胞活力及遷移率均顯著低于VSMCNC組（P＜0.05）。HG能升高VSMCNC及VSMCmiR-23b的細胞活力及遷移率，與對照組比較差異有統計學意義（P＜0.05），VSMCmiR-23b+高糖組的細胞活力及遷移率均顯著低于VSMCNC+高糖組（P＜0.05）。VSMCmiR-23b組的PI3KR1、Smad3的表達顯著低于VSMCNC組（P＜0.05）。高糖能升高VSMCNC及VSMCmiR-23b的PI3KR1、Smad3的表達。VSMCmiR-23b+高糖組的PI3KR1、Smad3的表達均顯著低于VSMCNC+高糖組（P＜0.05）。結論miR-23b可能通過調控靶基因Smad3、PI3KR1參與HG誘導的血管平滑肌增殖及遷移。

miR-23b；血管平滑肌；增殖；遷移；PI3KR1；Smad3

動脈粥樣硬化是一種由多種因素導致的慢性疾病，糖尿病（Diabetes mellitus，DM） 患者中的動脈粥樣硬化的發病率更高。研究證實：高糖（High glucose，HG）能誘導血管平滑肌細胞（Vascular smooth muscle cells，VSMCs）的增殖和遷移［1］，促進動脈粥樣硬化（Atherosclerosis，AS）的形成。微小核糖核酸（ microRNA，miRNA） 是一類真核生物高度保守長度為19～22個核苷酸的非編碼小分子RNA。miR-23b被證明在包括糖尿病在內的許多生理進程中起著重要的作用［2］。研究發現，miR-23b在損傷的血管壁中表達下降，升高miR-23b的表達能抑制VSMCs的增殖及遷移［3］。目前認為miR-23b可能參與血管平滑肌的增殖和遷移，但具體機制尚不清楚。本項目將對HG誘導VSMCs增殖及遷移的分子機制進行深入研究。

1 材料和方法

1.1 主要材料與試劑

DMEM細胞培養基、胎牛血清（FBS）、0.25%胰蛋白酶均購自GIBCO公司；SmGM-2培養基購自美國Lonza公司；D-葡萄糖（DG）、DAPI購自Sigma公司；Transwell小室購自BD公司；CCK-8溶液、BCA蛋白定量試劑盒、ECL顯影劑均購自上海碧云天生物技術公司；Lipofectamine 2000試劑購自Invitrogen公司；miR-23b mimics、negative control對照均購自廣東銳博生物有限公司；Trizol試劑盒購、RT-qPCR引物均購自Lifetechnologies公司；逆轉錄試劑盒及RT-qPCR 試劑盒購自Takara公司。

1.2 VSMCs的培養

人主動脈血管平滑肌細胞系T/G HA-VSMC購自美國ATCC，置于含有10%FBS的SmGM-2培養基，在37℃、5%CO2的細胞培養箱中培養，取3～5代處于對數生長期的細胞進行實驗。

1.3 構建過表達miR-23b VSMCs（VSMCmiR-23b）及對照細胞（VSMCNC）

當細胞生長至70%～80%融合時，接種于細胞瓶中，轉染過程均按照Lipofectamine 2000試劑說明書進行。將過表達miR-23b質粒（pEZX-MR04-miR-23b）及對照質粒（Negative control，NC）按照分別轉染到VSMCs細胞中，然后于37 ℃、5% CO2的細胞培養箱中培養48 h，改用含嘌呤霉素（2ng/mL）的培養基篩選72 h，構建過表達miR-23b的VSMC細胞VSMCmiR-23b以及對照細胞VSMCNC。

1.4 CCK-8法檢測細胞增殖

過表達miR-23b VSMCs細胞（VSMCmiR-23b）及對照細胞（VSMCNC），分別以2×103/孔鋪于96孔板。將高糖（40 mM）分別與VSMCmiR-23b及VSMCNC孵育24 h，每孔加入10μl CCK-8溶液，繼續培養1 h，酶聯免疫檢測儀測量490 nm處各孔的吸光值（OD），計算細胞活性。細胞活性（%）=藥物OD/對照OD×100%。

1.5 Transwell小室檢測細胞侵襲

分別將VSMCNC及VSMCmiR-23b細胞1×104/孔勻接種于鋪有基質膠的Transwell小室（上室）中，加入或不加入含高糖（40 mM）的DMEM培養基培養，下室加入含20%FBS的完全培養基，37℃培養24 h，用棉簽拭去小室內底部細胞，4%甲醛固定液固定小室外底部的細胞，DAPI染色，熒光顯微鏡下觀察各組細胞穿過小室的情況，統計穿過的細胞數目，對比高糖處理對VSMCNC及VSMCmiR-23b細胞遷移能力的影響。

1.6 RT-PCR檢測細胞中miRNA-23b及靶基因的表達量

根據Trizol試劑盒操作說明書提取總RNA，參照Takara逆轉錄試劑盒說明書進行逆轉錄，按SYBR Premix Ex Taq試劑盒說明書進行PDE4B （上游：5’- CAG ACC TGA AGA CAA TGG TAG AA-3’；下游：5’-GAC CTG AAT GCG ATC GGT ATA G -3’）、Smad3（上游：5’- CCA TCT CCT ACT ACG AGC TGA A -3’；下游：5’-CAC TGC TGC ATT CCT GTT GAC-3’）、β-actin（上游：5’-GGA CCT GAC TGA CTA CCT CAT -3’；下游：5’- CGT AGC ACA GCT TCT CCT TAA T -3’）的RT-qPCR檢測，以GAPDH作為內參計算PDE4B、Smad3的相對表達量。miR-23b及U6的逆轉錄采用All-in-One? miRNA qRT-PCR Detection Kit進行，采用All-in-One? miRNA qPCR Primer引物試劑盒進行miR-23b及U6的RT-PCR檢測，采用U6作為內參檢測miR-23b的相對表達量。

1.7 統計學分析

2 結果

2.1 高糖促進VSMC細胞增殖及抑制miRNA-23b表達

由圖1A可知，HG能濃度依賴性的促進VSMC細胞的增殖，與NC組（5.5 mM）比較，10 mM、20 mM和40 mM的HG均可以顯著的促進VSMC細胞的增殖，與NC組比較差異有統計學意義（10 mM：P=0.025；20 mM：P＜0.001；40 mM：P＜0.001），并且呈現出劑量依賴現象。還發現HG能濃度依賴性的抑制miR-23b的表達，結果如圖1B所示，10 mM、20 mM和40 mM的HG均可以劑量依賴性的降低miR-23b的表達量，與NC組比較差異有統計學意義（10 mM：P=0.006；20 mM：P＜0.001；40 mM：P＜0.001）。

圖1 高糖對VSMC細胞增殖及miRNA-23b表達的影響

2.2 過表達miR-26b降低高糖誘導的VSMC細胞增殖

如圖2A所示，VSMCmiR-23b組細胞中miR-23b的表達水平顯著升高，與VSMCNC組比較差異有統計學意義（P＜0.001）。VSMCmiR-23b+HG組的miR-23b表達也顯著高于VSMCNC+HG組（P＜0.001）。細胞活力結果圖2B所示，VSMCmiR-23b組的細胞活力顯著低于VSMCNC組（P＜0.001）。與VSMCNC組比較，VSMCNC+HG顯著的細胞活力升高（P＜0.001），VSMCmiR-23b+HG組的細胞活力顯著低于VSMCNC+HG組（P＜0.001）。

圖2 過表達miR-23b對高糖誘導VSMC細胞增殖的影響

2.3 過表達miR-23抑制高糖誘導的VSMC遷移

VSMCmiR-23b組的遷移率均顯著低于VSMCNC組（P＜0.001）。HG能顯著升高VSMCNC的遷移率，與VSMCNC組比較差異有統計學意義（P＜0.001），VSMCmiR-23b+HG組的遷移率均顯著低于VSMCNC+HG組（P＜0.001）。見圖3。

圖3 過表達miR-23對高糖誘導VSMC遷移的影響

2.4 過表達miR-23b抑制高糖誘導P13KR1及Smad3表達升高

qPCR檢測結果如圖4所示，VSMCmiR-23b組的PI3KR1、Smad3的mRNA表達顯著低于VSMCNC組（P＜0.05；P＜0.05）。高糖能升高VSMCNC及VSMCmiR-23b的PI3KR1、Smad3的表達（P＜0.001；P＜0.001）。VSMCmiR-23b+高糖組的PI3KR1、Smad3的表達均低于VSMCNC+高糖組（P＜0.05；P＜0.05）。

圖4 過表達miR-23b對高糖誘導P13KR1及Smad3表達的影響

3 討論

血管平滑肌細胞的異常增殖和遷移是動脈粥樣硬化發生的重要病理環節及機制，本研究利用HG誘導血管平滑肌的增殖和遷移的模型中研究miR-23b的作用。其中HG能濃度依賴性的抑制血管平滑肌細胞中的miR-23b的表達同時可以顯著的促進VSMC細胞的增殖。從本研究的結果可知，VSMCmiR-23b組的細胞活力及遷移率均顯著低于VSMCNC組。HG能升高VSMCNC及VSMCmiR-23b的細胞活力及遷移率，VSMCmiR-23b+高糖組的細胞活力及遷移率均顯著低于VSMCNC+高糖組。表明miR-23b對于細胞的活力和遷移率有顯著的負調節作用，高糖誘導可以增加這種效果。為了進一步研究miR-23b對于細胞的增殖和遷移率調節的原因，我們測定了PI3KR1、Smad3基因的表達量，PI3K是生長因子超家族信號傳導過程中的重要分子，可以調節細胞的凋亡、增殖、代謝、分泌等方面，PI3KR1基因負責編碼PI3K家族中表達量最多的調節亞基-p85α［4-5］。Smad3蛋白是轉化生長因子-β（TGF-β）的重要的信號轉導和調節分子，是TGF-β信號通路中重要的下游分子，與多種腫瘤細胞的生物學行為密切相關［6-7］。有研究發現，TGF-β1在促進內膜增生過程中發揮了非常重要的作用［8］，Smad3蛋白參與TGF-β的主要途徑，可以刺激VSMC的增生、遷移與分泌等功能［9］。從本次的研究結果可知，VSMCmiR-23b組的PI3KR1、Smad3的蛋白和mRNA的表達均顯著低于VSMCNC組，高糖能升高VSMCNC及VSMCmiR-23b的PI3KR1、Smad3的蛋白和mRNA的表達。VSMCmiR-23b+高糖組的PI3KR1、Smad3蛋白和mRNA的表達均顯著低于VSMCNC+高糖組。表明miR-23b可能通過降低VSMCs細胞中的PI3KR1、Smad3的表達量來影響細胞的增殖和遷移率。

綜上所述，在動脈粥樣硬化的發病過程中，miRNAs在VSMCs細胞中異常表達，調節VSMCs細胞的增殖及遷移來進一步影響動脈粥樣硬化的發展。本研究進一步發現，miR-23b在HG誘導的VSMC增殖中發揮重要的調控作用。而VSMC增殖功能可以誘發血管重建，從而進一步的導致動脈粥樣硬化等疾病的發生。本研究結果進一步闡明動脈粥樣硬化的發病機理，以及為抗動脈粥樣硬化尋找更為有效的治療靶點提供了理論依據。

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High Glucose Induced Vascular Smooth Muscle Cell Proliferation and Migration Through Suppressing miR-23b

YI Zhigang1GUO Wenan1WU Juan1HUANG Shangmeng1LI Jin1CHI Qinghua21 Health Care Ward，The First Affiliated Hospital of Xiamen University，Xiamen Fujian 361003，China，2 Teaching and Research Department of Nurse

ObjectiveHigh glucose induced vascular smooth muscle cell proliferation and migration is the key to atherosclerosis pathology caused by diabetes.The role of small RNA in diabetic vascular complications is taken seriously increasingly. This project will focus on the miR-23b on proliferation and migration induced by high glucose in vascular smooth muscle cell.MethodsVSMCs were incubated with high glucose（HG，40 mM）for 24 h. The expression of miR-23b induced by high dose glucose was detected by qPCR. In order to further confirm the role of miR-23b on sugar induced VSMC proliferation and migration，slow virus technology was used to construct an over-express miR-23b VSMCs （VSMCmiR-23b） and control cells （VSMCNC）.D-glucose incubate with VSMCmiR-23band VSMCNCrespectively for 24 h，VSMCs proliferation was tested by CCK8，the migration of VSMCs was analyzed by Transwell，the expression of miR-23b and its target genes（PI3KR1，Smad3） were detected by qPCR.ResultsCompared with the control group，D-glucose can significant inhibit the expression of miR-23b with concentration-dependent（P＜0.05）. Cell vitality and mobility in VSMCmiR-23bgroup were significantly lower than VSMCNCgroup（P＜0.05）. Compared with the control group，Glucose can significant raise the cell vitality and mobility in VSMCmiR-23band VSMCNC（P＜0.05）. The cell vitality and mobility of VSMCmiR-23b+ high glucose group were significantly lower than VSMCNC+ high glucose group（P＜0.05）. The expression of PI3KR1 and Smad3 in VSMCmiR-23bgroup was significantly lower than VSMCNCgroup（P＜0.05）. High glucose can raise the expression of PI3KR1 and Smad3 in VSMCmiR-23band VSMCNCgroup. The expression of PI3KR1 and Smad3 in VSMCmiR-23b+ high glucose group were significantly lower than VSMCNC+ high glucose group（P＜0.05）.ConclusionmiR-23b may participate in proliferation and migration induced by high glucose in vascular smooth muscle through regulating the target genes PI3KR1，Smad3.

miR-23b，VSMCs，Proliferation，Migration，PI3KR1，Smad3

R329.2

A

1674-9316（2016）24-0020-04

10.3969/j.issn.1674-9316.2016.24.011

福建省衛生廳青年科研課題（編號：2013-2-87）

1廈門大學附屬第一醫院保健病房，福建 廈門 361003；2 護理教研室

池清華，E-mail：fjxm0405@163.com