Gremlin在原發性開角型青光眼患者房水及小梁網組織中的表達及意義

Gremlin在原發性開角型青光眼患者房水及小梁網組織中的表達及意義

王 晶 張廣斌

目的檢測原發性開角型青光眼（Primary Open-angle Glaucoma，POAG）患者房水及小梁網組織中Gremlin的表達。方法取20例POAG患者房水及小梁網組織標本，取18例單純老年性白內障的房水及5例成年人尸眼的小梁網標本作為對照組。采用酶聯免疫吸附法（ELISA）測定房水中Gremlin的含量，應用免疫組織化學方法檢測小梁組織Gremlin的表達。結果POAG患者房水中的Gremlin含量明顯高于非POAG患者，差異具有統計學意義（P＜0.05）。POAG患者小梁細胞中Gremlin呈陽性表達，正常人的小梁網組織中Gremlin不表達。結論POAG患者房水及小梁細胞中Gremlin表達明顯增加，提示Gremlin在POAG發病中起重要作用。

原發性開角型青光眼；Gremlin；房水；小梁細胞；ELISA；免疫組織化學染色

原發性開角型青光眼（Primary Open-angle Glaucoma，POAG）的確切發病機制仍不十分明確。研究表明，小梁網細胞外基質合成增加，造成小梁網孔狹窄甚至閉塞，房水外排途徑受阻是導致眼內壓力升高的一個重要原因［1］。Gremlin基因最早從爪蟾中樞神經脊中克隆出來，廣泛存在于細胞外、內質網和高爾基氏體中［2］。2015年有學者發現，Gemlin能促進標志性蛋白α平滑肌肌動蛋白（α-SMA）、細胞外基質主要成分纖維連接蛋白（Fn）和Ⅰ型膠原纖維（COL-1）的表達［3］。2007年Robert J等［4］在研究TGF-β和BMP在POAG發病機制中的作用時，意外地發現了BMP拮抗劑Gremlin在體外培養的小梁網細胞中的高表達，并指出Gremlin的這種表達與眼壓高低成正相關，揭示了Gremlin在POAG的發生發展中起著重要的作用。本研究通過應用酶聯免疫吸附法（ELISA）測定20例POAG患者房水中的Gremlin含量，采用免疫組織化學方法檢測小梁網中Gremlin的表達，現將結果報告如下。

1 材料和方法

1.1 實驗組標本

選取2007年3～6月于我院住院確診為原發性開角型青光眼（中期或晚期）需行小梁切除術患者共20例，年齡35～65歲，平均年齡（55.70±6.59）歲。其中男性12例，女性8例。病程＞1年。所有患者均行穿透性小梁切除術，術中穿刺入前房后，抽取0.2～0.4 ml房水，被血液污染的標本棄去，立即置于1.5 ml Eppendorf管中，4℃，12 000 r/min離心15 min，取上清液，置于另一Eppendorf管中，-80℃保存備用。手術切除小梁網，標本立即置入4%多聚甲醛中固定，4℃保存備用。

1.2 對照組標本

選取18例診斷為單純老年性白內障擬行白內障手術患者，年齡50～65歲，平均年齡（55.39±3.29）歲。排除并發性白內障，排除伴發其他眼部疾病。白內障手術中抽取房水0.2～0.4 ml作為對照組。選取5例成年人尸眼，供體來自于眼庫，排除具有眼部疾病或惡性腫瘤患者。死亡4 h內取小梁網標本，固定與保存方法同實驗組。

1.3 主要試劑

Gremlin-ELISA試劑盒購自上海麥莎生物科技有限公司，兔抗人Gremlin多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司，抗人VEGF抗體、SABC免疫組織化學試劑盒和3，3’-二氨基聯苯氨（DAB）顯色試劑盒均購自武漢博士德公司。

1.4 操作方法

房水標本嚴格按照ELISA試劑盒里操作步驟進行，用Tecon酶標儀讀取吸光度（A）值，用標準品稀釋濃度和A值為坐標繪制曲線，從曲線中查得Gremlin含量（ng/ml）。小梁網標本固定，常規梯度酒精脫水，二甲苯透明，浸蠟包埋，連續切片制成5 μm標本。實驗組與對照組標本各取2片行常規HE染色，其余切片采用鏈霉菌親生物素蛋白—過氧化物酶標法（SP）進行免疫組織化學染色。結果以背景清晰、細胞胞漿內出現棕黃色顆粒為陽性，無棕黃色顆粒為陰性。

1.5 統計學方法

采用SPSS 17.0軟件進行統計學分析，計量資料用 （）表示，用兩獨立樣本t檢驗進行統計學處理，P＜0.05，差異有統計學意義。

2 結果

實驗組房水中Gremlin含量（560.02±20.59）ng/ml較對照組房水中Gremlin含量（83.09±10.16）ng/ml增高，P＜0.01，差異有統計學意義。見表1-2。

表2 兩組患者的平均Gremlin含量（）

表2 兩組患者的平均Gremlin含量（）

組別 Gremlin含量（ng/ml）實驗組對照組P 560.02±20.59 83.09±10.16＜0.01

免疫組織化學染色結果：對照組小梁結構完整，小梁網眼疏松，小梁細胞均勻分布，細胞胞漿中未見棕黃色陽性染色。POAG患者小梁網眼變窄或消失，部分纖維化，細胞中含有較多棕黃色顆粒或色素團塊，呈不規則分布（圖1-2）。

3 討論

POAG病程長，病情隱匿，易被患者忽視。確診時視神經和視乳頭多已發生不可逆的功能損害，造成視野缺損和視力下降。小梁網細胞外基質（ECM）主要由膠原蛋白、彈性蛋白、纖維連接蛋白及黏多糖組成［5］。一系列生長因子如EGF、TGF-β、MMP等能影響ECM的合成和降解，從而引起ECM的沉積增加，導致孔眼狹窄甚至閉塞，房水外流阻力增大，眼內壓升高。Gremlin基因最早從爪蟾中樞神經脊中克隆出來，是骨形態發生蛋白（Bone Morphogenetic，BMP）拮抗劑家族的新成員，包含C端有8個氨基酸環的半胱氨酸重復區域半胱氨酸結，是高度保守的糖化和磷酸化分泌型蛋白［6］。

2007年Robert［4］在研究TGF-β、BMP在POAG發病機制中的作用時，意外地發現在小梁網細胞及房水中BMP拮抗劑Gremlin的表達明顯增高。研究顯示通過定量PCR檢測青光眼模型和正常眼模型小梁網細胞中Gremlin的表達，前者的Gremlin含量為后者的16倍。在體外培養的兩組人眼前節模型中，一組在培養液里加入10 mg/ml Gremlin，另一組未添加Gremlin，4 d后對比兩組眼內壓，前者眼內壓顯著升高；將Gremlin從培養液中提取棄去，2 d后眼內壓有所下降。這一結果不僅提示Gremlin可能參與了POAG的發生發展，而且影響眼壓的升降。鑒于體外培養與體內環境的異同，本研究采用ELISA法測定了POAG患者與正常對照組患者房水中Gremlin的含量，結果顯示前者Gremlin含量較后者增高，差異有統計學意義（P＜0.05）。本次免疫組化結果顯示POAG患者小梁網細胞中Gremlin表達較正常對照組明顯增高，與Robert實驗結果一致。

表1 實驗組（20例）與對照組（18例）房水中Gremlin含量（ng/ml）

注：正常組小梁結構完整，小梁網眼疏松，小梁細胞貼附于小梁柱上，細胞胞漿中未見陽性染色（×40）；圖1 正常對照組免疫組織化學染色像；注：小梁內皮細胞脫落、變性，部分小梁網眼變窄，甚至閉塞，小梁細胞胞漿中見棕黃色陽性染色（×40）圖2 POAG患者小梁網免疫組織化學染色像

Gremlin究竟通過何種機制參與POAG發展？目前國內尚無關于Gremlin在眼部疾病中的研究。2007年Henala［7］等研究發現Gremlin具有促使上皮向間充質轉化的功能。Gremlin是α-肌動蛋白的上調因子，能促進小梁網細胞微絲肌動蛋白的表達。但是Gremlin的過度表達勢必引起肌動蛋白的過度表達，使小梁網攣縮，失去彈性，正常結構塌陷，從而不利于房水引流。

綜上所述，Gremlin在POAG的發生、發展中起著重要作用。對于Gremlin的研究也為臨床上POAG的檢測和治療提供了新思路，如房水中Gremlin含量的檢測能否作為POAG的篩查指標，抑制Gremlin的表達能否延緩POAG的發展。當然，本研究僅從ELISA和免疫組化的方法研究了房水和小梁網細胞中Gremlin的表達，需要進一步從動物實驗和細胞實驗證實Gremlin的作用。

［1］陳林，聞毅頤. 小梁網細胞外基質與原發性開角型青光眼的病因研究［J］. 中國實用眼科雜志，1998，16（2）：71-73.

［2］魯一兵，劉超. Gremlin研究進展［J］. 國際內科學雜志，2007，34（3）：166-169.

［3］裴澄，馬波，康前雁，等. Gremlin對人晶狀體上皮細胞轉分化和細胞外基質合成的影響［J］. 中華眼科雜志，2015，51（8）：597-603.

［4］Wordinger RJ，Fleenor DL，Hellberg PE，et al. Effects of TGF-beta2, BMP-4, and gremlin in the trabecular meshwork: implications for glaucoma［J］. Investigative Opthalmology & Visual Science，2007，48（3）：1191-1200.

［5］程君. 探討原發性青光眼的臨床治療［J］. 中國繼續醫學教育，2015，7（5）：64.

［6］高賢榮，劉寬芝. BMP-7和gremlin與糖尿病腎病［J］. 國際泌尿系統雜志，2004，24（3）：385-387.

［7］Lee H，O'Meara SJ，O'Brien C，et al. The role of gremlin, a BMP antagonist, and epithelial-to-mesenchymal transition in proliferative vitreoretinopathy［J］. Invest Ophthalmol Vis Sci.，2007，48（9）：4291-4299.

The Expression of Gremlin in the Aqueous Humor and Trabecular Meshwork of Patients With Primary Open–angle Glaucoma

WANG Jing ZHANG Guangbin Cataract Department，Xiamen Ophthalmic Center Affiliated to Xiamen University，Xiamen Fujian 361001，China

ObjectiveTo identify expression of Gremlin in aqueous humor（AH）and trabecular meshwork（TM）of normal control and patients with primary open-angle glaucoma（POAG）.MethodsAH were 20 cases of patients with POAG. TM specimens were taken from 5 normal persons and 18 cases of patients with simple senile cataract were selected as control group. The expression of Gremlin was studied with ELISA and immunohistochemistry.ResultsGremlin in AH with POAG were significantly higher than the control（P＜0.05）. The trabecular meshwork cells in all patients expressed Gremlin，while the results of the control group were negative.ConclusionGremlin were highly expressed in the AH and TM of the patients with POAG. It suggests that Gremlin played an important role on POAG.

Primary open-angle glaucoma，Gremlin，Aqueous humor，Trabecular meshwork，ELISA，Immunohistochemistry

R341

A

1674-9316（2016）24-0172-03

10.3969/j.issn.1674-9316.2016.24.101

廈門大學附屬廈門眼科中心白內障科，福建 廈門 361001 通訊作者：王晶，E-mail：916092710@qq.com