環介導等溫擴增技術在病原微生物檢測中的應用進展

林茂銳，楊華文 綜述 曹東林 審校

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環介導等溫擴增技術在病原微生物檢測中的應用進展

林茂銳，楊華文 綜述 曹東林 審校

環介導等溫擴增（loop-mediated isothermal amplification， LAMP）是一項新的核酸快速擴增技術，具有特異性高、速度快、操作簡單等特點，非常適用于現場檢測和基層檢測，在突發公共衛生事件中將起重要的作用。筆者簡要概述了LAMP技術在病原微生物檢測中的應用。

環介導等溫擴增；病原微生物

近年來，新發傳染病如寨卡病毒病、中東呼吸綜合征、傳染性非典型肺炎、登革熱等頻頻暴發，這些新發疾病既對我國傳染病的防控提出了更高要求，也警示我國傳染病的防控、診治依然是公共衛生問題的重要挑戰之一。建立和發展重大傳染病病原體快速、早期的實驗室診斷技術平臺并標準化，能及早明確傳染病病原體的類別及流行病學數據，為傳染病的預警、及時高效的防控及采取恰當的應急方案提供理論依據。環介導等溫擴增 （loop-mediated isothermal amplification， LAMP）技術是由日本科學家Notomi等［1］新開發的一種核酸等溫擴增方法。世界各國的微生物科研工作者運用LAMP技術及其衍生技術在臨床細菌、病毒、寄生蟲的快速檢測，食物中毒致病菌，動植物檢疫、環境及畜牧業等病原體的檢測方面已取得重大進展，隨著其技術體系的完善并與其他核酸擴增技術的交叉互補，可以預見該技術在傳染性疾病的初篩中將發揮極大作用。筆者簡要概述了LAMP技術在病原微生物檢測中的應用。

1 LAMP簡介

1.1 技術原理 利用Bst脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid， DNA）聚合酶和根據靶序列設計兩對（四條）特殊的內、外引物，特異性識別靶序列上的6個獨立區域，在等溫條件（60～65 ℃）啟動循環鏈置換反應保溫30～60 min，可擴增出超過109拷貝的靶序列，同時產生肉眼可見的白色沉淀（焦磷酸鎂）。反應進行時，內引物與目標DNA雜交后，啟動互補鏈合成，產生啞鈴狀DNA。隨后以自身為模板，進行DNA合成延伸，形成莖-環DNA結構，此為LAMP循環的起始結構。由于內引物雜交在莖-環的環上，引物鏈置換合成DNA產生一個有缺口的莖-環DNA中間媒介，在莖上附有目標序列。然后，再通過外引物，在莖的末端形成環狀結構，結果在同一鏈上互補序列周而復始，從而形成有多環的、花椰菜結構的莖-環DNA混合物，達到靶序列擴增的目的［1］。

1.2 技術優勢 LAMP 技術是類似于聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction， PCR）的一種核酸快速高效擴增方法，其優勢主要有：（1）擴增溫度恒定，無需變性DNA 雙鏈；（2）高特異性，針對靶基因片段的6個區域，設計4條引物，事先需明確這6個區域的順序；（3）靈敏度高，擴增DNA模板只需10個拷貝或更少，檢測線性范圍達5個數量級；（4）快速、高效擴增，目的DNA擴增時間為30～40 min，若在引物上再進一步改進，可大大提高其擴增效率，甚至可在20 min內完成，而且擴增DNA產率很高，肉眼即可觀察到白色沉淀；（5）操作簡便，一種方法為肉眼或添加熒光染料觀察，另一種方法利用濁度儀檢測擴增產物濁度；（6）成本低廉，無需特殊的培訓和設備，只需一個水浴鍋即可，適合大規模篩檢和基層衛生醫療機構檢驗［2］。

2 LAMP在病原微生物快速檢測中的運用

2.1 病毒檢測 Nyan等［3］利用LAMP方法檢測臨床血清樣本中乙肝病毒的基因亞型A-F，模板DNA采用標準試劑盒提取或直接將血清加熱后用于擴增，并與乙肝病毒標準血清盤比較，LAMP法最低檢測限可達10 U，特異性100%，適用于臨床標本檢測。Poon等［4］設計特異性引物、建立環介導反轉錄等溫擴增技術（reversetranscription loop-mediated isothermal amplification， RTLAMP），臨床樣本檢出率為64%，其較實時定量PCR靈敏度稍低，但高于常規PCR方法，成本較低，顯示具有在發展中國家或床邊檢測潛力。Rudolph等［5］首次證明采用RT-LAMP方法可快速檢出急性人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus， HIV）感染，具體方法是針對HIV-1 HXB2基因片段設計引物，采用RT-LAMP技術對HIV感染細胞株和病例血清進行檢測，并與抗體快速檢測及通過美國食品藥品管理局認證的其他免疫學方法比較，在更早的感染階段（早于2周）即可檢測出，還建議向即時檢驗方向發展，對于急性HIV感染的檢出和感染隨時監控具有重要意義。而Ocwieja等［6］運用生物信息學的方法針對HIV多種亞型（A、B、C、D、G）設計了一系列引物并篩選出最佳引物后，建立了RT-LAMP的方法，為后續建立即時檢驗方法打下了良好基礎。一種新的禽流感病毒于2013年在中國暴發后，Bao等［7］通過RT-LAMP技術建立了快速診斷方法，能有效從不同樣本來源（雞、鴿子、人及環境）擴增出目的基因，其最低檢測限可達到0.01 pfu，是RT-PCR法的10倍，也具有良好特異性，約30 min即可完成實驗，并在臨床標本中得到很好驗證。之后，Luo等［8］采用類似的RT-LAMP法建立快速檢測禽流感病毒，均顯示良好的有效性和快速性。Kaneko等［9］利用LAMP技術檢測單純皰疹病毒HSV-1、HSV-2及水痘-帶狀皰疹病毒（varicella-zoster virus，VZV），其敏感性10倍于PCR方法。此外，LAMP技術在檢測登革病毒［10］、EV71手足口病毒［11］、中東呼吸綜合征冠狀病毒［12］、星狀病毒［13］等方面均有報道，無論是DNA還是核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）病毒，LAMP均能快速檢測，尤其是在檢測RNA病毒時，省去了RT-PCR法中費時的反轉錄步驟，減少了交叉污染的機會，更加快捷方便。

2.2 細菌檢測 Maruyama等［14］最先應用LAMP技術檢測大腸桿菌O157：H7細胞中的stxA2基因，建立了原位LAMP（In Situ LAMP），與原位PCR比較，其擴增溫度更低，細胞損傷更小，擴增后的圖像也更清晰。曹東林等［15］建立了實時熒光環介導等溫擴增快速檢測結核分枝桿菌的方法，此擴增法對結核和非結核分枝桿菌標準菌株檢測的敏感性和特異性均為100%，最低檢測限可達102個菌/ml；檢測的敏感性為94.64%，特異性為96.55%，與定量PCR相比，其特異性相似，但敏感性更高。Li等［16］以具有呼吸病臨床癥狀患者的痰液為研究對象，證明了Rv2461c基因是LAMP方法檢測結核分枝桿菌的一個非常有效而明確的核酸擴增測試靶標，具有很高的敏感性和特異度。另外，Ou等［17］及Joon等［18］分別就肺結核和肺外結核患者標本建立LAMP檢測方法，以期能快速、早期診斷結核桿菌的感染。朱水榮等［19］針對嗜肺軍團菌mip基因設計5條引物，對血清型嗜肺軍團菌和非嗜肺軍團菌及其他細菌進行檢測，結果證明LAMP方法的檢出率高于傳統培養分離方法及定量PCR，適合基層檢驗部門及小型實驗室與現場監測等使用。Felsenstein等［20］針對兒童常見鏈球菌感染致咽炎，建立LAMP檢測方法，與特異抗原檢測及常規培養比較，具有更高的敏感性和特異性。此外，目前LAMP還成功用于志賀菌、碳青霉烯類抗生素耐藥鮑氏不動桿菌、大腸桿菌等細菌類病原微生物［21-23］，以上細菌研究結果均表明，與定量PCR比較，LAMP技術擴增速度更快、敏感性和特異性也很高。

2.3 寄生蟲檢測 Cook等［24］在對無臨床癥狀的瘧原蟲感染者，通過LAMP法進行大規模的篩選，并與膠體金快檢法、定量PCR法比較，證明了LAMP法和PCR法均具有較高的陽性檢出率，但是LAMP法更快捷，儀器要求更低。楊秋林等［25］利用LAMP法擴增日本血吸蟲尾蚴DNA，以華支睪吸蟲為陰性對照，建立方便快捷的檢測方法。Matovu等［26］分別采用LAMP和PCR方法對患者血液標本中的錐蟲進行檢測，結果表明PCR法用時約長于LAMP法5倍。另外，Fallahi等［27］對剛地弓形蟲RE和B1基因分別進行LAMP擴增和巢式PCR，結果兩種方法特異性都很高，近乎100%，但前者的敏感性更高。Ocker等［28］對150例連續性瘧疾患者標本分別采用LAMP法、顯微鏡觀察法、巢式PCR法檢測，結果顯示LAMP法的敏感性和特異性與巢式PCR法高度一致。此外，LAMP還可用于真菌的檢測，如白色念珠菌及支原體的檢測［29，30］。

3 拓 展

3.1 擴增模板的拓展 針對細菌檢測，LAMP主要檢測其相應特異、保守的基因（DNA片段），而一些RNA病毒則需在反應體系中增加反轉錄環節，但一般為避免交叉污染，反轉錄與LAMP反應在同一體系中進行并最終形成RT-LAMP法［31］。對于病原體標本，LAMP法對模板要求不高，無需對樣本的核酸提取純化。部分廠家為了應對快速檢測的要求，甚至對一些標本采用一次性注射器加入核酸提取試劑，不進行復雜提取過程即可行LAMP擴增，在應用中更快速、簡便，減少交叉污染的機會。

3.2 擴增產物檢測方法的變化 對于LAMP擴增產物的檢測目前主要有4種方法：（1）經瓊脂糖電泳，溴化乙錠（ethidium bromide，EB）染色觀察梯度條帶。LAMP反應中的產物是一系列具有不同長度的莖環結構DNA混合物，用凝膠電泳分析時會產生特異的梯狀條帶。（2）肉眼觀察。在產物中加入SYBR Green I染料，呈現綠色即說明有目的擴增產物，這為現場病原體快速初篩提供了思路和可能。（3）通過對LAMP擴增副產物焦磷酸鎂白色沉淀形成的渾濁程度進行判斷。目前，已有公司成功開發出一種實時濁度檢測儀，對靶序列可進行定量分析。（4）在LAMP擴增過程中加入染料，通過儀器實時觀察顏色的變化而對靶序列進行定量分析。

3.3 與其他分子生物學技術的聯合應用 LAMP技術可聯合其他分子生物學技術。2013年，Wang等［32］應用原位LAMP，用于檢測食物樣本中的食源性副溶血性弧菌，與常規LAMP、PCR法進行了比較，結果證明原位LAMP是一種高敏感、高特異的檢測方法。而Lang等［33］以Her-2/neu （c-erbB2）基因為靶標，通過LAMP進行基因擴增后利用熒光原位雜交的方法來檢測乳腺癌的早期診斷，成本低廉。Hsieh等［34］采用一步法在現場利用微流控裝置與LAMP技術結合進行沙門氏菌DNA的擴增，擴增過程實時監控，擴增時間少于1 h，建立了一種快速、敏感、定量的病原體DNA擴增方法。

目前，LAMP技術的研究重點是如何篩選特異性高的擴增引物，以及擴增產物檢測的簡便性、實時監控、準確性和反應速度。而標本核酸提取便捷性亦是科研工作者著力想解決的一個問題。LAMP技術具有操作簡單、高特異性、高擴增效率、目的DNA判斷簡易、無需昂貴的儀器和試劑等優點，非常適用于即時檢驗初篩及現場的快速應急檢測，是核酸研究領域的重要技術手段，在病原微生物的應急檢測中必將發揮越來越大的作用。

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（2016-06-14 收稿 2016-09-08 修回）

（責任編輯 潘奕婷）

Progress on the application of loop-mediated isothermal amplification in detection of pathogenic microorganism

LIN Maorui， YANG Huawen， and CAO
Donglin. Department of Clinical Laboratory， The Second People's Hospital of Guangdong Province， Guangzhou 510317， China

CAO Donglin， E-mail： caodl@126.com

Loop-mediated isothermal amplification （LAMP） technology is a new nucleic acid isothermal amplification technology developed in recent years. Because of its high specificity， rapidity， and simplicity， it is very suitable for field detection and basic level detection and play an important role in public health emergencies. In this paper， the application of LAMP technology in detection of pathogenic microorganisms are briefly summarized.

loop-mediated isothermal amplification； pathogenic microorganism

R44

10.13919/j.issn.2095-6274.2016.10.014

2013年度廣東省級財政技術研究開發與推廣應用專項資金項目（粵財工［2013］401號）

林茂銳，本科學歷，主管技師，E-mail： 269160833@qq.com

510317 廣州，廣東省第二人民醫院檢驗科

曹東林，E-mail： caodl@126.com