Bx亞型1例血清學與分子生物學分析

喬鄭磊， 戎瑞明， 吳擘颋， 陸 瓊， 蔣 密*

1.復旦大學附屬中山醫院輸血科，上海 200032 2.復旦大學附屬中山醫院上海市器官移植重點實驗室，上海 200032 3.上海市血液中心，上海 200051

研究簡報

Bx亞型1例血清學與分子生物學分析

喬鄭磊1， 戎瑞明2， 吳擘颋1， 陸 瓊3， 蔣 密1*

1.復旦大學附屬中山醫院輸血科，上海 200032 2.復旦大學附屬中山醫院上海市器官移植重點實驗室，上海 200032 3.上海市血液中心，上海 200051

ABO血型；Bx亞型；正反定型不符

輸血是現代醫療中重要的救治手段之一，正確的血型鑒定在輸血工作中有極其重要的意義。ABO血型有多個亞型[1-2]。若血清學顯示ABO血型正反定型不符及抗原性減弱，很容易造成忽視和漏檢，給臨床血型鑒定、交叉配血及器官移植等帶來極大的困擾，給臨床輸血帶來危險。最近我們在臨床送檢樣本中發現了1例正反定型不符的樣本，并對其進一步做血清學以及基因測序分析，最終確定為Bx亞型，現報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 患者女性，68歲，漢族，2014年12月14日開始無明顯誘因出現胸悶不適伴心前區隱痛，經檢查確認為主動脈夾層，2014年12月26日入院準備手術治療。

1.2 試劑與儀器 微柱凝膠卡：ABO正定型(Biorad，批號：50053.71.09，美國)，ABO反定型(Grifols，批號：71351116024011841，瑞典)；低離子抗人球蛋白凝膠卡(Biorad，批號：500531.07.15，瑞典)；標準細胞ABO(上海血液生物醫藥有限責任公司，批號：20145327)，抗體篩選細胞(上海血液生物醫藥有限責任公司，批號：20147829)?？?A、抗-B(上海血液生物醫藥有限責任公司，批號：20145120)，人源抗-A、抗-B(上海市血液中心自制)，ABO正定型采用IH-1000全自動血型儀(Biorad，AHC973A，美國)，ABO反定型采用WADiana全自動配血儀(Grifols，ACC73A，瑞典)。

1.3 血清學試驗

1.3.1 血型鑒定 初次血型鑒定中ABO正定型采用IH-1000全自動血型儀，ABO反定型采用WADiana全自動配血儀。試管法按文獻[3]方法進行，應用篩選細胞和一組試劑譜細胞進行抗體篩選和抗體鑒定，明確或排除不規則抗體。

1.3.2 吸收放散試驗 取2 mL患者紅細胞，用0.9%氯化鈉溶液洗滌3次。取等體積的抗A與抗B血型定型試劑，與壓積紅細胞混合，4℃吸收1 h，將壓積紅細胞用足量的4℃ 0.9%氯化鈉溶液充分洗滌5次，取最后1次洗液2滴，分別加入4% A1細胞與B細胞，離心觀察。將吸收后的壓積紅細胞加1 mL 0.9%氯化鈉溶液，于56℃水浴中放散10 min，期間輕輕振蕩1 min，1 000×g離心1 min。取放散液各2滴，分別加入4%A1細胞與B細胞，振蕩混勻，1 000×g離心1 min，觀察結果。

1.4 基因組DNA提取 采用天根生化科技(北京)有限公司DNA提取試劑盒快速抽取基因組DNA。紫外分光光度計檢測DNA濃度。

1.5 外顯子6、7擴增與測序 采用的引物按照Olsson等[4]的設計(表1)，均由上海生物工程公司合成。PCR反應體系包括：dNTP終濃度為400 μmol/L、Mg2+終濃度為2.5 μmol/L、10×PCR緩沖液5 μL、Taq酶終濃度為0.5 U、模板DNA終濃度為100～300 ng/L、引物終濃度為0.1 μmol/L，終反應體系為50 μL。PCR反應在PE 9600擴增儀上進行，循環參數為：95℃ 10 min，94℃ 60 s，63℃ 90 s，72℃ 60 s，10個循環；94℃ 60 s，61℃ 90 s，72℃ 60 s，25個循環；72℃ 10 min，4℃保存。10 μL產物經2%瓊脂糖電泳鑒定產物的特異性。擴增產物經TaKaRa DNA Fragment Purification Kit[寶生物工程(大連)有限公司]純化，然后送上海生工生物工程公司測序。并分別以A101、B101、O101等位基因序列作對照，按照文獻[5]中的方法進行結果分析。

表1 第6、7號外顯子引物序列

2 結 果

2.1 血清學試驗結果 見表2。

表2 血型血清學試驗結果

2.2 吸收放散試驗結果 放散液與標準B細胞反應強度為1+S，與O細胞不反應，表明患者紅細胞的放散液中有抗-B抗體存在，證實其細胞表面存在B抗原。

2.3 H抗原強度比較 患者細胞與標準B細胞、標準O細胞的抗-H反應強度依次為：標準O細胞(4+)、患者細胞(3+)、標準B細胞(2+)。

2.4 基因測序結果 ABO基因測序結果顯示，外顯子6出現261 G缺失與297 A>G兩個突變位點。外顯子7出現526 C>G，646 T>A，657 C>T，681 G>A，703 G>A，771 C>T，796 C>A，803 G>C，905 A>G，930 A>G，1 096 G>A共11個突變位點(圖1)。

圖1 第7號外顯子基因測序圖

3 討 論

B亞型是正常ABO抗原以外的抗原較弱的亞型或變異型，主要有B3、Bw、Bel、Bx等共9種亞型[4]。B亞型的產生主要是由于半乳糖轉移酶第7外顯子某些堿基發生缺失或者替換，導致半乳糖轉移酶活性降低或者改變，從而導致紅細胞表面B抗原數量減少。B亞型血清學的主要特征是：與抗B發生不凝集或弱凝集，而與抗AB凝集，紅細胞能吸附和放散抗B抗體[5]。在某些白血病患者中，B抗原可暫時減弱為弱B形式，如同B亞型的表現。本例患者排除血液病，被檢患者紅細胞與標準A細胞反應強凝集，與抗B反應僅顯示較弱的凝集，而與抗A+B出現明顯凝集反應，表明患者血清中含有正常的抗A及較弱的抗B；紅細胞吸收能力弱于正常人的紅細胞，放散能力強于正常紅細胞，與抗H反應顯示O型類似的強凝集，表明該樣本為B亞型。

人類ABO基因定位于第9號染色體上，共有7個外顯子，多數編碼序列位于第6、7外顯子。B等位基因的點突變只是在703、796、803位高度保守。B亞型等位基因除具有703、796、803位高度保守的點突變外，第7外顯子還出現新的點突變，如C502T、G539A、G871A、C873G、C1036G、A1037T、C1054T、G1055A等[6-7]。目前發現的Bx亞型有9種[8]，分別為Bx01～09，其主要的突變點為 Bx01：871 G>A；Bx02：905 A>G；Bx03：541 T>C；Bx04：588 C>G；Bx05：976 G>T；Bx06：900 G>C；Bx07：808 T>A；Bx08：550 G>A；Bx09：889 G>A。對第6和第7外顯子進行擴增測序，測序結果顯示：第6外顯子出現261G缺失與297 A>G兩個突變位點，表明該標本為BO基因雜合。第7外顯子直接測序出現526 C>G、646 T>A、657 C>T、681 G>A、703 G>A、771 C>T、796 C>A、803 G>C、905 A>G、930 A>G、1096 G>A，表明該標本為Bx02與O02的雜合。

Bx亞型是ABO血型中B型紅細胞上抗原量減少所致，往往容易被誤定為O型。若B亞型患者輸入O型血液，或者O型血液的患者輸入了B亞型血液，都可能會出現嚴重的輸血反應。由于Bx亞型血液中含有較強的抗B抗體，這類符合輸血指征的患者應該考慮給予輸注AB型血漿和O型洗滌紅細胞[9]。

血型鑒定作為現代輸血前檢測最關鍵的步驟之一，其準確的檢測結果是確保輸血安全的重要保證。當出現正反定型不符時，應該結合血清學及分子生物學方法，正確分析血型，以免漏檢亞型，進而確保臨床輸血安全。

[1] LAZAR T.Human blood groups : chemical and biochemical basis of antigen specificity[J].Transfusion,2001,41(8):1077.

[2] SCHENK-BRUNNER H.ABO(H) system[M].2nd ed, New York:Springer,2000:118-161.

[3] 中華人民共和國衛生部.中國輸血技術操作規程(血站部分)[M].天津:科學技術出版社,1997:62-64.

[4] OLSSON M L, CHESTER M A.Polymorphisms at the ABO locus in subgroup A individuals[J].Transfusion, 1996,36(4):309-313.

[5] CHESTER M A, OLSSON M L.The ABO blood group gene: a locus of considerable genetic diversity[J].Transfus Med Rev, 2001,15(3):177-200.

[6] 喻 瓊, 吳國光, 梁延連, 等.一個中國漢族ABO血型B亞型家系中發現新的B等位基因[J].中華醫學遺傳學雜志,2005,22(2):129-133.

[7] 涂源泉, 郭 萍, 羅 臻, 等.Bx亞型1例臨床分析[J].臨床和實驗醫學雜志,2010,9(15):1174.

[8] 劉 偉, 李代紅, 劉 純.Bx亞型1例的分子生物學鑒定[J].中南大學學報(醫學版),2011,36(12):1213-1216.

[9] SIMON T L, SNYDER E L, SOLHEIM B G, et al.Rossi’s Principles of Transfusion Medicine[M].4th ed.Oxford: Blackwell Publishing Ltd, 2009.

[本文編輯] 廖曉瑜， 賈澤軍

Serological and molecular biological studies of Bx subtype: case report

QIAO Zheng-lei1, RONG Rui-ming2, WU Bo-ting1, LU Qiong3, JIANG Mi1*

1.Department of Blood Transfusion, Zhongshan Hospital, Fudan University, Shanghai 200032, China 2.Shanghai Key Laboratory of Organ Transplantation, Zhongshan Hospital, Fudan University, Shanghai 200032, China 3.Shanghai Blood Center, Shanghai 200051, China

ABO blood group; Bx subtype; blood typing discrepancy

2016-08-08[接受日期]2016-09-13

喬鄭磊，碩士，技師.E-mail: qiao.zhenglei@zs-hospital.sh.cn

*通信作者(Corresponding author).Tel: 021-64041990-2829, E-mail: jiang.mi@zs-hospital.sh.cn

10.12025/j.issn.1008-6358.2016.20160791

R 457.1+1

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