糞產堿桿菌AF01產可溶性胞外多糖發酵條件的優化

蔣樟麗,韓福霞,金澤霖,張 翼,高紅亮,常忠義,賈彩鳳

(上海市華東師范大學生命科學院,上海 200241)

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糞產堿桿菌AF01產可溶性胞外多糖發酵條件的優化

蔣樟麗,韓福霞,金澤霖,張 翼,高紅亮,常忠義,賈彩鳳*

(上海市華東師范大學生命科學院,上海 200241)

糞產堿桿菌(AlcaligenesFaecalis)AF 01產可溶性胞外多糖(EPS),本文采用單因素和正交實驗設計,對其進行發酵優化研究。實驗結果表明,最優發酵培養基:蔗糖50 g/L,KNO31.1 g/L,酵母膏0.5 g/L,CaCO315 g/L;最優發酵條件為:發酵時間4 d,初始pH7.0,接種量為2.5%,轉速200 r/min,溫度30 ℃。在此條件下,該菌株可溶性胞外多糖的產量有了極大的提高,達到10.8 g/L,為該胞外多糖的規模化生產提供了重要的參考。

糞產堿桿菌,可溶性胞外多糖,發酵優化

胞外多糖(exopolysaccharide,EPS)是微生物在生長代謝過程中產生并分泌到細胞外的長鏈、高分子聚合物[1]。因其產糖周期短、自然因素干擾小、產品容易分離的生產優勢,胞外多糖在工業上受到日益重視,已作為穩定劑、膠凝劑、成膜劑、乳化劑等被廣泛應用于食品、石油、制藥、化妝品等領域,具有廣闊的應用前景。

早在1965年,科學家從糞產堿桿菌發酵液中得到一種新的酸性可溶性多糖-琥珀酰多糖[2],該多糖是由D-葡萄糖和D-半乳糖組成的八糖重復單位,其中含有丙酮酸、乙酸及丁二酸取代基,分子量在6×106～1.5×107u之間[3]。隨后該多糖相繼被報導從黃桿菌屬[4]、放射性土壤桿菌[5-6]和其他糞產堿桿菌中[7]產生。由于該多糖具有酸性、且可溶于水的特性,已經應用于化妝保健[8]、醫藥[9-10]等領域。但目前國內關于糞產堿桿菌發酵所產生的可溶性胞外多糖生產方面的研究尚未有報導,因此這種胞外多糖還具有巨大的探究空間。本文對糞產堿桿菌AF 01產可溶性的胞外多糖的發酵條件進行優化,以期對該多糖的進一步研究與開發應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

糞產堿桿菌AF 01 由華東師范大學生命科學學院微生物與發酵實驗室保存。

斜面培養基(g/L):葡萄糖40,酵母膏5,CaCO310,瓊脂20,pH7.0。種子培養基(g/L):葡萄糖20,酵母膏10,CaCO33,pH7.0[11]。基礎發酵培養基(g/L):葡萄糖40,NH4Cl 1.5,酵母膏1,CaCO35,MgSO4·7H2O 0.5,K2HPO41.71,KH2PO42.72,pH7.0[11]。所用試劑均為AR級 購自國藥集團化學試劑有限公司。

電子天平,精密度為0.1 mg,梅特勒-托利多儀器 (上海)有限公司;超凈工作臺 北京東聯哈爾儀器制造有限公司;恒溫培養箱 北京東聯哈爾儀器制造有限公司;CR21N型立式離心機 天美(中國)科學儀器有限公司;DHG-9246A型烘箱 上海精宏實驗設備有限公司;DK-S24型恒溫水浴鍋 上海精宏實驗設備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養條件 將兩環斜面種子接入30 mL種子培養基中,30 ℃,200 r/min振蕩培養24 h,作為種子液。培養好的液體種子以5%接種量接入250 mL錐形瓶裝液30 mL發酵培養基中,30 ℃,200 r/min振蕩培養。

1.2.2 發酵液的取樣處理 取發酵液,90 ℃水浴加熱3 min使蛋白變性凝結,冷卻后,室溫 9000 r/min離心10 min,分離上清和沉淀備用。

1.2.3 胞外可溶性多糖產量的測定 取發酵液上清0.5 mL,通過苯酚-硫酸法[11]在OD490條件下進行檢測。

1.2.4 菌體干重的測定 取發酵液沉淀,加入蒸餾水重懸,1000 r/min離心5 min,棄去沉淀CaCO3,菌體懸液9000 r/min離心5 min,用蒸餾水洗滌菌體沉淀,重復2次,將沉淀在80 ℃烘箱中烘干過夜至恒重[12]。

1.3 實驗設計

首先利用單因素實驗篩選對糞產堿桿菌EPS產量影響顯著的因素,選擇影響顯著的因子進行3水平的正交實驗設計。

1.3.1 單因素實驗

1.3.1.1 最佳碳源的選擇 分別以40 g/L的葡萄糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖、淀粉和甘油替換基礎發酵培養基中的碳源,其它培養基成份不變,30 ℃,200 r/min振蕩培養糞產堿桿菌AF 01 4d,用以考察碳源對可溶性EPS產量的影響。

然后基礎培養基中分別添加質量濃度為20、30、40、50、60 g/L的蔗糖,培養4d后,檢測碳源濃度對EPS產量的影響。

1.3.1.2 最佳無機氮源的選擇 以優選后的蔗糖為碳源,分別以1.5 g/L NH4Cl、(NH4)2SO4、NH4H2PO4、KNO3、NH4NO3、草酸銨替換基礎培養基中無機氮源,培養糞產堿桿菌4 d,考察無機氮源對EPS產量的影響。

基礎培養基中分別添加質量濃度為0.7、1.1、1.5、1.9、2.3 g/L的KNO3,培養4 d后,考察無機氮源濃度對EPS產量的影響。

1.3.1.3 酵母膏濃度對可溶性EPS產量的影響 在基礎培養基中,分別添加質量濃度為0.5、1、3、5、7 g/L的酵母膏,發酵結束后,檢測酵母膏濃度對EPS產量的影響。

1.3.1.4 CaCO3添加量對可溶性EPS產量的影響 在基礎培養基中,分別添加質量濃度為1、5、10、15、20 g/L的CaCO3,發酵結束后,檢測CaCO3添加量對EPS產量的影響。

1.3.1.5 pH、接種量、溫度、轉速及發酵時間的優化 選用優化后的產糖培養基進行發酵條件優化。在接種量5%、溫度30 ℃、轉速200 r/min 的條件下培養4 d,測定發酵培養基不同初始pH(5、6、7、8、9)對EPS 產量的影響。在培養基初始pH為7、溫度30 ℃、轉速200 r/min 的條件下培養4 d,測定接種量(1%、2.5%、5%、7.5%、10%)對EPS 產量的影響。在培養基初始pH7、接種量5%、轉速200 r/min的條件下培養4 d,測定發酵溫度(25、28、30、33、37 ℃)對EPS 產量的影響。在培養基初始pH為7、接種量5%、溫度30 ℃的條件下培養4 d,測定轉速(160、180、200、220 r/min)對EPS產量的影響。在pH7、接種量5%、溫度30 ℃、轉速200 r/min 的條件下培養,測定發酵時長(1、2、3、4、5、6 d)對EPS產量的影響。

1.3.2 正交實驗優化發酵產EPS的培養條件 通過以上一系列單因素實驗探究,選擇對菌體產胞外多糖較為顯著的蔗糖濃度、酵母膏濃度、菌液接種量和發酵溫度作為實驗因子,分別以四個因素的最佳條件為參考各設置3個水平,進行L9(34)正交實驗,設計如表1所示。

表1 正交實驗因素水平表L9(34)
Table 1 Factors and levels of L9(34)orthogonal design

水平因素A蔗糖濃度(g/L)B酵母膏濃度(g/L)C接種量(%)D發酵溫度(℃)13005152524012530350153535

1.4 統計分析

所有實驗做3個平行,利用Excel和SPSS對實驗結果進行數據分析。

2 結果與分析

2.1 培養基成份對可溶性EPS產量的影響

2.1.1 碳源種類和濃度對EPS產量的影響 碳源作為細胞生長最重要的能量與營養來源,對EPS產生具有重要作用。所選擇的不同碳源對可溶性EPS產量的影響如圖1A所示,而蔗糖為碳源時EPS產量顯著高于其他碳源(p<0.05),達到5.90 g/L,因此我們選擇蔗糖為碳源做進一步的研究。

圖1 碳源種類及濃度對可溶性EPS產量的影響Fig.1 Effect of carbon source type and concentration on soluble EPS yield

圖1B可知,隨著蔗糖濃度升高,菌體干重逐漸增加,EPS產量不斷提高,當蔗糖濃度為40 g/L時,胞外多糖產量達到最高值,為6.57 g/L。隨著蔗糖濃度的進一步升高,EPS產量稍有下降。其原因是蔗糖含量過低時,由于碳源被過早消耗,所以影響了胞外多糖的產生;蔗糖含量過高,會抑制菌體的生長和胞外多糖的合成產生,影響EPS的產量,這與王爽[13]等報道的結果一致,因此選用蔗糖濃度為40 g/L做進一步的研究。

2.1.2 無機氮源種類和濃度對可溶性EPS產量的影響 由圖2A可知,糞產堿桿菌可以利用不同的無機氮源產生EPS,采用KNO3作為無機氮源時,EPS產量最高,達到6.04 g/L。因此選擇KNO3為最佳的無機氮源,進行下一步的研究。

如圖2B所示,隨著無機氮源KNO3濃度的增加,菌體干重增多,但當KNO3濃度超過1.5 g/L后,菌體干重無顯著性增加,說明過高的無機氮源限制了菌體的生長。當KNO3質量濃度較低時,隨著KNO3質量濃度的增大,無機氮源供應增多,EPS產量增加,當KNO3質量濃度為1.1 g/L時,EPS產量達到最高點。KNO3質量濃度繼續增大,產生的大量菌體要消耗更多的碳源來維持自身的生長和代謝,導致胞外多糖產量相對下降。因此,1.1 g/L為KNO3最佳質量濃度。

2.1.3 酵母膏濃度對EPS產量的影響 培養基中加入少量酵母膏可以促進菌體生長,其中的生長因子對發酵后期產物的合成也有一定的促進作用[14]。基礎培養基中加入不同質量濃度的酵母膏對EPS產量的影響如圖3所示。

圖3 酵母膏濃度對可溶性EPS產量的影響Fig.3 Effect of yeast extract concentration on soluble EPS yield

由圖可知,酵母膏濃度為1 g/L時,菌體胞外多糖產量達到最高,之后隨著酵母膏質量濃度的增加,菌體干重繼續增多,但胞外多糖的產量逐漸降低,故酵母膏最佳質量濃度為1 g/L。

2.1.4 最佳CaCO3添加量的確定 糞產堿桿菌在生長過程會使培養基pH降低,為了維持培養液的pH范圍,更利于菌體的生長,在培養基中分別加入不同質量的CaCO3,結果如圖4所示。

圖4 CaCO3添加量對可溶性EPS產量的影響 Fig.4 Effect of CaCO3 concentration on soluble EPS yield

隨著CaCO3濃度的增高,菌體干重不斷增加,EPS產量逐漸上升。原因可能是菌體代謝產生了酸性環境,而CaCO3的添加抑制了酸性環境對菌體生長的影響。當CaCO3的添加量為15 g/L時,菌體胞外多糖產量達到最高值,隨著CaCO3添加量繼續增加,胞外多糖產量會略有下降,故CaCO3的最佳添加量應該為15 g/L。

2.2 培養條件對EPS產量的影響

2.2.1 發酵時長對EPS產量的影響 以蔗糖作為基礎發酵培養基的碳源,其余培養基成份不變,30 ℃,200 r/min振蕩培養,探究發酵時長對EPS產量影響的結果如圖5所示。

圖5 發酵時間對可溶性EPS產量的影響Fig.5 Effect of culture time on soluble EPS yield

隨著培養時間的延長,EPS的產量緩慢上升,到第4 d達到最高值5.44 g/L,之后逐漸下降。這是由于培養前期隨著菌體的生長,菌體代謝所產胞外多糖產量逐漸增加,而第4 d后,培養基中碳源不足,菌體轉而利用自身所產多糖作為碳源維持自身代謝及繁殖[15]。因此發酵時長4 d為最佳培養時間。

2.2.2 菌液接種量對EPS產量的影響 接種量直接影響發酵液內的最初活菌數,從而影響菌體的生長以及EPS 的生物合成。如圖6所示,菌體干重隨著接種量的增大而增加,而胞外多糖產量出現先增多后下降的趨勢。接種量過少,菌體需更多時間繁殖,從而延遲了多糖的產生;接種量過多,菌體間競爭過于激烈,且需要更多碳源維持大量菌體生長,使其產糖受到抑制。故選擇2.5%作為產EPS的最適接種量,這一結果與蹇華麗等[16]的報道一致。

圖6 接種量對可溶性EPS產量的影響Fig.6 Effect of inoculation amount on soluble EPS yield

2.2.3 培養基初始pH對EPS產量的影響 pH能改變微生物的相關酶活性與菌體代謝途徑,因此微生物的生長及代謝產物的合成受到培養基pH的影響。如圖7所示,初始pH偏低或偏高,會影響菌體的生長,同時影響EPS的生成。培養基初始pH為7.0時菌體干重達到最高值,EPS產量也達到最高點。

圖7 培養基初始pH對可溶性EPS產量的影響Fig.7 Effect of initial pH on soluble EPS yield

2.2.4 發酵溫度對EPS產量的影響 如圖8所示,發酵溫度為28～30 ℃時,EPS產量較高且菌體干重也較多。當溫度較低時,菌體生長、代謝緩慢,EPS產生受到影響;溫度較高時,會影響到菌體內酶的活性,從而影響菌體的生長代謝及EPS的產生。

圖8 發酵溫度對可溶性EPS產量的影響Fig.8 Effect of fermentation temperature on soluble EPS yield

圖9 搖床轉速對可溶性EPS產量的影響Fig.9 Effect of rotation speed on soluble EPS yield

2.2.5 搖床轉速對EPS產量的影響 糞產堿桿菌是好氧菌,搖床轉速會影響供氧量,從而使菌體的生長代謝及其產物的合成受到影響。如圖9所示,搖床轉速過低,會導致供氧不足,菌體會生長緩慢,EPS產量較低;搖床轉速過高,培養基溶氧量過高,細胞呼吸、代謝旺盛,會使其過早衰亡,從而導致菌體對碳源等物質的利用及產物的合成受到影響,EPS產量下降。因此,最佳搖床轉速應設置為200 r/min。

2.3 正交實驗確定產EPS的最佳培養條件

通過單因素實驗,初步確定組成如下的最佳培養基配方:蔗糖40 g/L,KNO31.1 g/L,酵母膏1 g/L,CaCO315 g/L;最佳發酵培養條件:菌液接種量2.5%,初始pH7.0,發酵溫度30 ℃,搖瓶轉速200 r/min。

選擇對產EPS影響較為顯著的蔗糖濃度、酵母膏濃度、菌液接種量和發酵溫度作為實驗因子,分別以四個因子的最佳條件為參考各設置3個水平,進行L9(34)對產EPS發酵培養基組成進行優化,設計與結果見表2。

由表2極差分析可知,4個因素對糞產堿桿菌產EPS影響的大小順序為:蔗糖>酵母膏>發酵溫度>菌液接種量。綜合比較各因素不同水平胞外多糖產量,最終確定該四因素最佳組合條件:蔗糖50 g/L,酵母膏0.5 g/L,菌液接種量2.5%,發酵溫度30 ℃。按照該條件進行3次驗證實驗,得到的EPS的平均值為10.8 g/L,顯著提高了EPS的產量。

表2 正交實驗表設計和結果分析
Table 2 The orthogonal design scheme and result analysis

實驗號ABCD胞外多糖產量(g/L)1111145962122233223133310714212370135223149426231264447313210753832133308933218462k12996745447836000k26133385762666840k37508532655893797R4512359714833043因素主次排序1243

3 結論

通過單因素實驗,從培養基組成和培養條件探討了糞產堿桿菌產EPS的最佳條件,然后在此基礎上,選擇對EPS產量影響較為顯著的蔗糖濃度、酵母膏濃度、菌液接種量和發酵溫度,進行了L9(34)正交實驗設計。最終得到的最優化培養條件為:蔗糖50 g/L,KNO31.1 g/L,酵母膏0.5 g/L,CaCO315 g/L,MgSO4·7H2O 0. 5 g/L,KH2PO42. 72 g/L,K2HPO41.71 g/L;發酵培養的最佳條件為:發酵時間4 d,菌液接種量2.5%,培養基初始pH7.0,發酵溫度30 ℃,搖瓶轉速200 r/min。在此最優方案下,糞產堿桿菌AF 01胞外多糖的產量達到10.8 g/L。

因此,優化得到最優糞產堿桿菌產EPS的發酵條件真實可靠,具有實際意義,對今后該多糖的進一步研究奠定了基礎。

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Optimization of fermentation conditions for soluble extracellular polysaccharide production by Alcaligenes Faecalis AF 01

JIANG Zhang-li,HAN Fu-xia,JIN Ze-lin,ZHANG Yi,GAO Hong-liang,CHANG Zhong-yi,JIA Cai-feng*

(School of Life Sciences,East China Normal University,Shanghai 200241 China)

For the production of exopolysaccharide(EPS)fromAlcaligenesFaecalisAF01,single-factor test and orthogonal experimental design were employed to optimize the fermentation conditions. The results showed that the optimal medium components were consisted of 50 g/L sucrose,1.1 g/L KNO3,0.5 g/L yeast extract and 15 g/L CaCO3. The optimal fermentation conditions were incubation time of 4 d,the initial pH of 7.0,2.5% inoculum amount,shaking speed of 200 r/min and culture temperature of 30 ℃.Under the optimized conditions,the yield of the soluble extracellular polysaccharide was significantly improved and a maximum EPS yield of 10.8 g/L was achieved. The optimized medium and our results provided some important data for commercial production of this polysaccharide.

Alcaligenesfaecalis;soluble extracellular polysaccharide;fermentation condition optimization

2016-06-24

蔣樟麗(1994-),女,在讀本科,研究方向：食品微生物，E-mail：zljiang1994@163.com。

*通訊作者:賈彩鳳(1979-),女,博士,高級實驗師,研究方向:食品微生物,E-mail:cfjia@bio.ecnu.edu.cn。

TS201.3

A

1002-0306(2016)23-0165-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.23.023