BRCA2在卵巢癌中的表達(dá)及其與臨床病理的相關(guān)性

王 莉，周 珂，孫華清，孟俊英

BRCA2在卵巢癌中的表達(dá)及其與臨床病理的相關(guān)性

王 莉，周 珂，孫華清，孟俊英

目的 比較乳腺癌易感基因2（breast cancer suscepbility gene 2，BRCA2）在卵巢癌組織中的表達(dá)及其與臨床病理因素的相關(guān)性，分析其作為早期卵巢癌診斷基因的可行性。方法采用熒光定量PCR的方法研究BRCA2 RNA在卵巢上皮癌、正常卵巢組織中的表達(dá)差異，并進(jìn)一步應(yīng)用western－blotting的方法檢測(cè)BRCA2蛋白的表達(dá)。結(jié)果其BRCA2 RNA在卵巢癌組織中的表達(dá)量低于正常卵巢組織（P＜0．05）；BRCA2 RNA在臨床Ⅲ～Ⅳ期的表達(dá)量低于臨床Ⅰ～Ⅱ期（P＜0．05）。BRCA2 RNA與CA125在卵巢癌中的表達(dá)無(wú)相關(guān)性（P＜0．05）。BRCA2蛋白在卵巢癌中的表達(dá)量同樣低于正常卵巢組織（P＜0．05）。結(jié)論BRCA2在卵巢癌的發(fā)生發(fā)展中起著一定作用，其與CA125的聯(lián)合監(jiān)測(cè)有望提高卵巢癌的陽(yáng)性診斷率。

卵巢癌；BRCA2；基因表達(dá)；蛋白表達(dá)

卵巢癌是婦科最常見(jiàn)惡性腫瘤，其發(fā)病率僅次于宮頸癌和子宮內(nèi)膜癌，具有早期癥狀隱匿、預(yù)后差、死亡率高的特點(diǎn)［1］。由于缺乏敏感及特異性較高的早期篩查手段，一旦發(fā)現(xiàn)大多為中晚期。因此，早期診斷是提高卵巢癌患者5年生存率的關(guān)鍵。然而卵巢癌早期診斷方法較少，靈敏度及特異性不高，因此尋找有效的血清標(biāo)志物對(duì)卵巢癌早期診斷及預(yù)后有著極其重要的意義。

乳腺癌易感基因 2（breast cancer susceptibility gene 2，BRCA2）是迄今發(fā)現(xiàn)的與乳腺癌發(fā)生有關(guān)的易感基因，在調(diào)節(jié)人體細(xì)胞的復(fù)制、遺傳物質(zhì)DNA損傷修復(fù)、細(xì)胞的正常生長(zhǎng)方面有重要作用。它的異常表達(dá)與乳腺癌早期發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［2］。目前該基因在卵巢癌發(fā)生發(fā)展中的作用也受到日益關(guān)注。本研究應(yīng)用熒光定量PCR、Western blot技術(shù)監(jiān)測(cè)BRCA2在卵巢癌患者中的表達(dá)并進(jìn)一步分析其臨床意義。

1 資料與方法

1．1 標(biāo)本采集收集筆者所在醫(yī)院2012年1月—2013年12月手術(shù)切除的卵巢上皮癌標(biāo)本共35例（患者年齡35～74歲），其中漿液性囊腺癌18例、黏液性囊腺癌13例，子宮內(nèi)膜癌2例，透明細(xì)胞癌2例。另取23例正常卵巢組織作為對(duì)照，患者術(shù)前均未行化療，每例卵巢癌患者術(shù)前抽取靜脈血采用電化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)CA125。

1．2 方法

1．2．1 卵巢組織細(xì)胞中總RNA提取、反轉(zhuǎn)cDNA使用QIAGEN RNA提取試劑盒，按照說(shuō)明書(shū)提取組織細(xì)胞中的總RNA。簡(jiǎn)略如下：Trizol溶解樣本溶漿液，4℃離心，上清加入等體積異丙醇，離心，乙醇沉淀，DEPC水溶解。使用隨機(jī)引物、反轉(zhuǎn)錄酶采用常規(guī)RT－PCR方法，將總RNA反轉(zhuǎn)成cDNA，－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1．2．2 熒光定量PCR檢測(cè)卵巢組織細(xì)胞中BRCA2表達(dá) PCR反應(yīng)體系：10×緩沖液 2．5 μl，Mg2+（25mMol）1．5 μl，dNTP（各10mMol）0．75 μl，DNA聚合酶0．25 μl，ROX（250×）0．1 μl，上游引物0．5 μl，下游引物0．5 μl，探針0．3 μl，ddH2O 0．3 μl，ddH2O 14．6。分別對(duì)應(yīng)加入21 μl PCR反應(yīng)液于96孔PCR反應(yīng)板中，每個(gè)孔待測(cè)樣本的cDNA加4 μl。放入熒光定量PCR儀器中測(cè)定。反應(yīng)條件：48℃反應(yīng)30 min，然后94℃保溫5 min，再按94℃20 s→60℃30 s循環(huán)40次。

1．2．3 Western blot檢測(cè)BRCA2蛋白表達(dá) 組織置于冰上研磨碾碎，每100 mg加入0．2 ml細(xì)胞裂解液，冰上充分裂解30 min，12000 r／min離心收集上清，將蛋白于6%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離。分離后將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜37℃封閉1 h。兔抗人BRCA2（一抗稀釋度1∶1 000）β－actin（一抗稀釋度1∶500）4℃孵育過(guò)夜，漂洗，加二抗1∶2000 37℃孵育1 h滴加發(fā)光試劑暗室曝光顯示條帶。

1．3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS11．5統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析，統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用t檢驗(yàn)、Pearson相關(guān)性檢驗(yàn)。P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 熒光定量PCR檢測(cè)BRCA2表達(dá)將收集到的35例卵巢癌組織和23例正常卵巢組織的cDNA按照標(biāo)準(zhǔn)操作程序進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，每個(gè)標(biāo)本設(shè)3個(gè)復(fù)孔，每個(gè)標(biāo)本分別進(jìn)行BRCA2和βactin表達(dá)量的檢測(cè)。三復(fù)孔每個(gè)指標(biāo)取平均值，分別計(jì)算BRCA2與β－actin表達(dá)量的比值，計(jì)算中位數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果顯示BRCA2 RNA在卵巢癌組織中的表達(dá)量為0．81±0．12，而正常卵巢組織中的表達(dá)量為2．62±1．86，BRCA2在卵巢癌組織中的表達(dá)量顯著低于正常卵巢組織 （P＜0．01）。

2．2 Western blot檢測(cè)結(jié)果從35例卵巢癌標(biāo)本中選擇10例，正常卵巢組織選擇8例，進(jìn)行BRCA2蛋白水平表達(dá)差異的檢測(cè)。將該18例標(biāo)本進(jìn)行組織勻漿，使用BRC蛋白定量試劑盒將各標(biāo)本蛋白總量調(diào)整統(tǒng)一，使用抗BRCA2和抗β－actin進(jìn)行Western blot檢測(cè)。在分子量384KD處可見(jiàn)BRCA2和43kD處可見(jiàn)β－actin特異性蛋白條帶。圖像灰度分析后，將BRCA2蛋白條帶與β－actin蛋白條帶進(jìn)行比值計(jì)算，顯示BRCA2卵巢癌為0．52±0．21，正常卵巢組織中為1．62±0．11。說(shuō)明BRCA2蛋白在卵巢上皮癌中的表達(dá)顯著低于正常卵巢組織（P＜0．01）。

圖1 BRCA2在卵巢癌和正常卵巢組織中的電泳結(jié)果

2．3 BRCA2 RNA表達(dá)與卵巢癌臨床病理因素的關(guān)系BRCA2 RNA表達(dá)在不同年齡、病理類型（因子宮內(nèi)膜癌及透明細(xì)胞癌病例數(shù)少，未納入比較）、腫瘤分化程度和臨床分期間差異結(jié)果見(jiàn)表1，BRCA2蛋白表達(dá)在臨床Ⅲ～Ⅳ期的表達(dá)率低于臨床Ⅰ～Ⅱ期（P＜0．05）。

2.4 BRCA2 RNA與CA125的相關(guān)性分析Pearson相關(guān)分析顯示，BRCA2 RNA與CA125在卵巢癌中的表達(dá)沒(méi)有關(guān)聯(lián)性（P＞0．05）。

3 討論

表1 BRCA2在不同臨床病例特征卵巢癌中表達(dá)量的統(tǒng)計(jì)分析

由于卵巢癌早期多無(wú)明顯癥狀，并且卵巢又位于盆腔的深部，平時(shí)較難捫及，因此卵巢癌一旦發(fā)現(xiàn)均為中晚期，是女性癌癥死亡的主要原因。血清癌胚抗原125（CA125）是篩查卵巢癌指標(biāo)之一，但是其敏感度及特異度不高［3］。基于上述原因，進(jìn)一步尋找卵巢癌新的腫瘤標(biāo)志物以便于對(duì)卵巢癌做出早期診斷及治療成為研究的熱點(diǎn)。

有研究發(fā)現(xiàn)BRCA2基因定位于13q12－13的一組與乳腺癌發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后有重要關(guān)系的抑癌基因。基因組DNA長(zhǎng)約70 kb，編碼區(qū)10987 kb，共27個(gè)外顯子，第11外顯子是最大的外顯子，是DNA修復(fù)相關(guān)蛋白51（DNA damage repair protein 51，RAD51）結(jié)合的位點(diǎn)。BRCA2的mRNA長(zhǎng)約10 kb，編碼抑制腫瘤的BRCA2蛋白，該蛋白由3418個(gè)氨基酸殘基組成［4］。BRCA1／2作為腫瘤抑制基因，在維護(hù)染色體結(jié)構(gòu)和數(shù)目穩(wěn)定方面具有重要作用。當(dāng)基因突變發(fā)生后，通過(guò)改變其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)促使染色體不穩(wěn)定而失活，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展［5－7］。

該研究結(jié)果表明，BRCA2 RNA在卵巢癌組織中的表達(dá)下調(diào)，由此推測(cè)BRCA2基因可能與卵巢癌的發(fā)生密切相關(guān)，該基因在卵巢癌中同樣發(fā)揮著抑癌基因的作用。同時(shí)BRCA2在晚期卵巢癌中的表達(dá)低于早期，推測(cè)該基因不但有望作為早期卵巢癌的檢測(cè)基因，并且可能參與了卵巢癌的病程進(jìn)展。CA125是目前應(yīng)用較為廣泛的卵巢上皮癌的腫瘤標(biāo)志物，但是其敏感度及特異度偏低，并且多在晚期卵巢癌中升高，因此為了提高卵巢癌的早期診斷率，目前認(rèn)為將2～3個(gè)較為敏感的腫瘤標(biāo)志物同時(shí)用于診斷以提高卵巢癌的早期診斷率。該研究顯示，BRCA2 RNA與CA125在卵巢癌中的表達(dá)沒(méi)有相關(guān)性，因此兩者的聯(lián)合診斷可能會(huì)提高卵巢癌的診斷率。

該研究結(jié)果同時(shí)顯示，BRCA2蛋白在卵巢癌組織中的表達(dá)低于正常卵巢組織，同基因的表達(dá)結(jié)果相一致。BRCA2蛋白不僅有可能作為卵巢癌的腫瘤標(biāo)志物，用于卵巢癌的診斷，而且有可能作為卵巢癌免疫治療的靶目標(biāo)，在卵巢癌的治療中發(fā)揮作用。

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［2015-10-20收稿，2015-11-19修回］

［本文編輯：吳 蓉］

Expression of breast cancer suscepbility gene 2 in ovarian carcinoma tissue and its clinicopathological significance

WANG Li，ZHOU Ke，SUN Hua-qing，et al.
Dept.of Gynecology and Obstetrics，No.153 Hospital of Chinese PLA，Zhengzhou，Henan 450042，China

Objective To study the expression of breast cancer suscepbility gene 2（BRCA2）in ovarian carcinoma and its clinicopathological significance，to analyse the feasibility of BRCA2 as a diagnostic gene of early ovarian carcinoma．MethodsThe expression of BRCA2 RNA in ovarian epithelial carcinoma and normal tissues was detected by PCR，then the expression of BRCA2 protein in those tissues was detected by western－blotting．Results The expression level of BRCA2 RNA in ovarian carcinoma was lower than that in normal ovarian tissues（P＜0．05）．The expression level of BRCA2 RNA in stageⅢ－Ⅳ was lower than stageⅠ－Ⅱ （P＜0．05）．There was no correlation between BRCA2 and CA125 values（P＜0．05）．The expression of BRCA2 protein in ovarian carcinoma was also lower than that in normal ovarian tissues（P＜0．05）．ConclusionBRCA2 might play an important role in ovarian occurrence and development．The simultaneous determination of BRCA2 and CA125 may increase the sensitivity for diagnosis of ovarian carcinoma．

Ovarian carcinoma；Breast cancer suscepbility gene2（BRCA2）；Gene expression；Protein expression

R737.31：R730.43

A

10.14172/j.issn1671-4008.2016.04.007

450042河南鄭州，解放軍153醫(yī)院婦產(chǎn)科（王莉，周珂，孫華清，孟俊英）