口腔扁平苔蘚病灶中Toll樣受體4與TNF－α的表達＊

王學瑩，宋典坤

口腔扁平苔蘚病灶中Toll樣受體4與TNF－α的表達＊

王學瑩，宋典坤

目的 探討TLR4、TNF－α在口腔扁平苔蘚（OLP）發(fā)病中的可能作用。方法 采用免疫組化法檢測OLP組與正常對照組口腔黏膜蠟塊標本中TLR4、TNF－a的表達；采用qRT－PCR法檢測TLR4的基因表達。結果OLP組中的TLR4、TNF－α蛋白及TLR4 mRNA表達均顯著高于對照組 （P＜0．05）；TNF－α蛋白與TLR4蛋白表達呈正相關（P＜0．05）。結論 OLP病灶部位TLR4 mRNA表達激活，TLR4、TNF－α表達增多，與OLP局部炎癥和破壞的遷延不愈有關。

口腔扁平苔蘚；Toll樣受體4；腫瘤壞死因子α

口腔扁平苔蘚（oral lichen planus，OLP）是一種慢性炎癥性疾病，病因不清，一般認為是T細胞介導的免疫反應［1］。病理上表現(xiàn)為上皮下淋巴細胞帶狀浸潤，侵犯上皮基底細胞層，引起角質形成細胞損傷。持續(xù)的T淋巴細胞浸潤導致該炎性病變遷延不愈［2］。Toll樣受體（Toll like receptors，TLRs）屬于模式識別受體，在固有免疫和獲得性免疫中發(fā)揮作用［3］。TLRs表達于多種免疫和非免疫細胞表面，識別諸如脂多糖、肽葡聚糖、脂蛋白等病原相關分子，啟動和控制固有免疫反應。TLRs在許多慢性炎癥性疾病的發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用，但其在OLP中的作用仍不明確。本研究OLP患者口腔黏膜組織中TLR4的基因表達，TLR4、TNF－α蛋白的表達，探討TLR4、TNF－α在OLP發(fā)生發(fā)展中的可能作用。

1 材料與方法

1．1 試劑與儀器兔抗人TLR4多克隆抗體（北京博奧森），兔抗人TNF－α多克隆抗體 （北京博奧森），小鼠超敏二步法免疫組化試劑盒pv－9002（北京中杉金橋生物技術公司），RNeasy FFPE Kit（QIAGEN，German），PrimeScript RT reagent Kit（TAKARA，Japen），SYBR Premix Ex TaqTMII（TAKARA，Japen），TLR4 （引 物 序 列 F－5’－CTGGAAATATGACCACAGTCAGAA－3’，R－5’－TCAATCACCCTAGACCTGCTCAA－3’），內(nèi)參基因GAPDH（引物序列：F－5’－GCACCGTCAAGGCTG AGAAC－3’，R－5’－TGGTGAAGACGCCAGTGGA－ 3’），Light Cycler○R480 system（Roche Diagnostics，瑞士）。

1．2 材料收集福建醫(yī)科大學附屬協(xié)和醫(yī)院病理科2011年7月—2012年2月間病理診斷為OLP的蠟塊標本30例（男9，女21），患者年齡22～65歲，平均（45．2±9．4）歲。其中頰黏膜20例，舌部黏膜8例，下唇黏膜1例，前庭溝黏膜1例，將30例OLP病損黏膜按病變類型分為兩組：糜爛型（16例）和非糜爛型（14例）。另取10例正?？谇火つぃ∟OM）作為對照組。

1.3 免疫組化法檢測口腔黏膜組織TLR4及TNF－α蛋白的表達采用SP法進行免疫組化染色。TLR4抗體工作濃度1∶100，TNF－α抗體工作濃度1∶50，以PBS液代替一抗作為陰性對照。用二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色試劑盒顯色，蘇木素輕度復染，系列乙醇脫水，二甲苯透明，封片，顯微鏡下觀察免疫組化染色結果。判斷標準：采用著色強度和陽性細胞率綜合分析法。著色強度計分：按陽性細胞著色無、弱（淡黃）、中（棕黃）、強（棕褐）分別計0、1、2、3分；每例對象切片隨機選取5個400倍視野觀察，按陽性細胞占總細胞數(shù)的比例計分：0%～10%、11%～25%、26%～50%、51%～75%、＞75%，分別計0、1、2、3、4分。按上述兩項分數(shù)之和分級作為表達強度：0～1分為（－）；2～3分為弱陽性（+）；4～5分為中等陽性（++）；6～7分為強陽性（+++）。

1．4 qRT－PCR法檢測蠟塊標本中TLR4的基因表達每個組織蠟塊按RNeasy FFPE Kit說明書要求切片并提取總RNA，并測濃度和純度?？俁NA根據(jù)PrimeScriptTMRT reagent Kit要求步驟逆轉錄成cDNA。根據(jù)SYBR Premix Ex TaqTMII要求配置PCR反應液，應用LightCycler○ R480 system擴增儀進行PCR反應，內(nèi)參基因GAPDH與待測基因同批擴增，根據(jù)擴增產(chǎn)物的Ct值，以2－ΔΔCt法計算目的基因相對表達量。

1．5 統(tǒng)計學分析SPSS 13．0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。免疫組化表達結果采用等級資料成組Wilcoxon秩和檢驗，多組間的表達采用Kruskal－Wallis秩和檢驗。TLR4 mRNA的表達為計量資料，以±s表示，采用成組t檢驗，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析；相關關系采用Spearman相關檢驗，P≤0．05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2．1 TLR4、TNF－α免疫組化染色TLR4蛋白表達于細胞質和／或細胞核，呈黃色或棕黃色顆粒。在NOM組中，TLR4只表達與上皮基底層，表達強度明顯弱于OLP組織，陽性率20%（2／10）；在OLP組織中，TLR4表達強度由基底層、棘細胞層、顆粒層、角質層逐漸減弱，黏膜下層TLR4表達較上皮層減弱，表達于浸潤的淋巴細胞，陽性率為90%（27／30），其中，糜爛型陽性率100%，非糜爛型78．6%。OLP組的TLR4蛋白表達強度顯著高于對照組（P＝0．000），糜爛型OLP組織TLR4表達強度陽性率顯著高于非糜爛型OLP組織（P＝0．005），見表1及圖1。

表1 TLR4免疫組化結果

圖1 TLR4蛋白在各組中的表達（×100）

TNF－α蛋白表達于口腔黏膜角質形成細胞和炎性浸潤細胞，定位于細胞質，其在NOM組中上皮全層均有散在表達，陽性率20%（2／10）；在OLP組中，TNF－α表達于上皮基底細胞層、棘層及浸潤淋巴細胞的細胞質，陽性率為90%（27／30），其中，糜爛型陽性率100%，非糜爛型78．6%。OLP組的TNF－α蛋白表達強度顯著高于對照組 （P＝0．000），但兩型之間則無顯著性差異（P＝0．229），見表2及圖2。

表2 TNF－α免疫組化結果

圖2 TNF－α蛋白在各組中的表達（×100）

2．2 TLR4的mRNA表達經(jīng)單因素方差分析，NOM組TLR4mRNA表達低于非糜爛型OLP組、糜爛型OLP組（P＝0．000），差異有統(tǒng)計學意義；而經(jīng)成組 t檢驗，OLP組中糜爛型和非糜爛型 TLR4 mRNA的表達無明顯差異（P＝0．153）。見圖3。

圖3 TLR4 mRNA在各組的表達

2．3 TLR4與TNF－α表達的相關分析經(jīng)Spearman相關分析，TLR4蛋白表達與TLR4mRNA呈正相關（r＝0．575，P＝0．000），相關性一般；TLR4蛋白表達與TNF－α的表達顯著正相關（r＝0．836，P＜0．05）。

3 討論

目前，TLRs被認為參與自身免疫性疾病以及肺、腎、胃腸道、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病乃至癌癥的發(fā)生發(fā)展，其介導的上皮免疫反應在結腸炎、牛皮癬、扁平苔蘚、復發(fā)性阿弗他潰瘍的等其他上皮的慢性炎癥中起著重要作用［4，5］。TLRs能識別微生物的特異性分子結構，從而導致炎癥因子和／或INF－I的增多。而不同的TLRs識別不同的微生物特異性分子結構，如本研究涉及的TLR4能識別革蘭陰性菌LPS。口腔本身具有復雜的微生物環(huán)境，TLR4可表達于原代培養(yǎng)的牙齦上皮細胞、健康牙齦和牙周炎的牙齦上皮、結締組織，其表達強度與炎癥程度正相關［6，7］。正常情況下，口腔黏膜受到一系列模式識別受體所介導的精確調節(jié)反應保護，防止?jié)撛谕{入侵。革蘭陰性菌在OLP病灶部位顯著增多［8］，能識別LPS的TLR4表達也相應增多。Yana的研究發(fā)現(xiàn)OLP組織中，TLR4的免疫組化陽性率較正常組織顯著增高［9］，在LPS誘導建立的OLP細胞模型中，TLR4的基因和蛋白表達均明顯增強。Siponen的研究也證實了，TLR4在OLP組織中表達顯著增高，特別是在萎縮糜爛型中，基底層較中間層、表層及黏膜下炎癥浸潤層顯著增高［10］。Janarhanam等除了證實了OLP病灶TLR4的高表達，還發(fā)現(xiàn)OLP患者口腔脫落上皮細胞TLR4 mRNA的表達較正常細胞增高［11］。同樣，該研究OLP病灶中TLR4 mRNA表達增強，TLR4蛋白的表達較正常組明顯增多，可見，TLR4通過識別病原分子，誘發(fā)一系列級聯(lián)反應，導致OLP的發(fā)生。

TNF－α作為一種受NF－κB調控的細胞因子［12］，能刺激血管內(nèi)皮細胞、角質形成細胞產(chǎn)生黏附分子、趨化分子，引導T淋巴細胞從血管內(nèi)游出，參與炎癥反應。NF－κB信號通路的激活是TLR4調節(jié)免疫反應的關鍵環(huán)節(jié)［13］。許野等［14］通過實驗發(fā)現(xiàn)在OLP病灶中TLR4與NF－κB p65的蛋白協(xié)同表達，提出TLR4通過對NF－κB p65的正向調節(jié)，參與OLP的病理過程。宋典坤等［15］的研究也發(fā)現(xiàn)NF－κB p65在OLP組中的表達明顯高于NOM組，陽性染色定位于棘細胞、基底層細胞及固有層淋巴細胞的胞質和胞核，與本研究中TNF－α、TLR4陽性表達位置一致。綜合上述研究及本研究結果可推測：OLP病灶部位增多的革蘭陰性菌和脫落上皮激活了OLP部位TLR4 mRNA轉錄，TLR4蛋白相應表達增多，識別病原相關分子，與相應受體結合，啟動和激活NF－κB通路，促進TNF－α表達增多，而TNF－α的大量表達產(chǎn)生，導致T淋巴細胞浸潤基底層，而增多的T淋巴細胞又分泌TNF－α，導致黏膜局部炎癥和破壞的發(fā)生和遷延不愈。

現(xiàn)有對OLP基因表達的研究多采用新鮮取材的標本，但活檢并不是OLP診斷的必須手段，從而限制了這類研究的樣本量。本研究探索性地以商品化的試劑盒提取既往的石蠟包埋組織蠟塊中的RNA進行TLR4基因表達的研究，可測得總的mRNA表達量，為OLP的研究提供了新的方法。OLP由于病因不清，尚無有效的治療方法。而本研究發(fā)現(xiàn)TLR4可能參與OLP發(fā)病的啟動環(huán)節(jié)，對TLR4－NF－κB p65－TNF－α這一通路的監(jiān)測和抑制，有望成為OLP診斷和治療的新方向。

［1］Roopashree MR，Gondhalekar RV，Shashikanth MC，et al．Pathogenesis of oral lichen planus－a review［J］．J Oral Pathol Med，2010，39（10）：729－734．

［2］Sugerman PB，Savage NW，Walsh LJ，et al．The pathogenesis of oral lichen planus［J］．Crit Rev Oral Biol Med，2002，13（4）：350－65．

［3］Kawai T，Akira S．The role of pattern－recognition receptors in innate immunity：update on Toll－like receptors［J］．Nat Immunol，2010，11（5）：373－384．

［4］Curry JL，Qin JZ，Bonish B，et al．Innate immune－related receptors in normal and psoriatic skin［J］．Arch Pathol Lab Med，2003，127（2）：178－186．

［5］Furrie E，Macfarlane S，Thomson G，et al．Toll－like receptors－2，－3 and－4 expression patterns on human colon and their regulation by mucosal－associated bacteria［J］．Immunology，2005，115（4）：565－574．

［6］Beklen A，Hukkanen M，Richardson R，et al．Immunohistochemical localization of Toll－like receptors 1－10 in periodontitis［J］．Oral Microbiol Immunol，2008，239（5）：425－431．

［7］Rojo－Botello NR，Garc1′a－Hernandez AL，Moreno－Fierros L．Expression of toll－like receptors 2，4 and 9 is increased in gingival tissue from patients with type 2 diabetes and chronic periodontitis［J］．J Periodontal Res，2012，47（1）：62－73．

［8］Bornstein MM，Hakimi B，Persson GR．Microbiological findings in subjects with asymptomatic oral lichen planus：a crosssectional comparative study［J］．J Periodontol，2008，79（12）：2347－2355．

［9］Yana Ge，Ye Xu，Wenjing Sun，et al．The molecular mechanisms of the effect of Dexamethasone and Cyclosporin A on TLR4／NF－κB signaling pathway activation in oral lichen planus［J］. Gene，2012，508（2）：157-164．

［10］Siponen，Joonas HK，Ylermi Soini，et al．TLR4 and TLR9 are induced in oral lichen planus［J］．Oral Pathol Med，2012，41（10）：741－747．

［11］Janardhanam SB，Prakasam S，Swaminathan VT，et al．Differential expression of TLR－2 and TLR－4 in the epithelial cells in oral lichen planus［J］．Archives of Oral Biology，2012，57（5）：495－502．

［12］Rhodus NL，Cheng B，Bowles W，et al．A comparison of the proinflammatory，NF－ kappaB－dependentcytokines：TNF－alpha，IL－1－alpha，IL－6，and IL－8 in different oral fluids from oral lichen planus patients［J］．Clin Immunol，2005，114（3）：278－283．

［13］Carmody RJ，Chen YH．Nuclear factor－kappa B：Activation and regulation during toll－like receptor signaling［J］．Cell Mol Immunol，2007，4（1）：31－41．

［14］許 野，夏現(xiàn)印，趙凌波，等．Toll樣受體4及核因子－κBp65在口腔扁平苔蘚中的表達及意義［J］．實用口腔醫(yī)學雜志，2013，29（2）：231－235．

［15］宋典坤，關為群，王學瑩，等．ALX－R和NF－κBp65在口腔扁平苔蘚病灶中的表達研究［J］．現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生，2005，31（20）：3050－3055．

［2015-10-15收稿，2015-11-14修回］

［本文編輯：韓仲琪］

The expression of Toll like receptor 4 and TNF－α signal pathway in oral lichen planus lesion

WANG Xue-ying，SONG Dian-kun.
Fujian Medical University Union Hospital，F(xiàn)uzhou，F(xiàn)ujian 350001，China

Objective To investigate the possible role of TLR4 and TNF－α in OLP．Methods Immunohistochemistry was used to detect the expression of TLR4，TNF－α in the oral mocusa of patients with OLP and normal oral mucosa （control group），respectively．Quantitative real－time PCR was used to detect the expression of mRNA of TLR4．ResultsThe IHC expression of TLR4，TNF－α in OLP was significantly stronger than those in control group（P＜0．05），TLR4 mRNA expression did so．There was positive correlation between the expression of TNF－α and TLR4（P＜0．05）．ConclusionThe high expression and activation of TLR4 and increased expression of TNF－α may have some relation to long－lasting inflammation and destruction in the lesion of OLP．

Oral lichen planus（OLP）；Toll like receptor 4；Tumor necrosis factor－α

R781．31

A

10.14172/j.issn1671-4008.2016.04.019

福建省自然科學基金面上項目（2013J01314）

350001福建福州，福建醫(yī)科大學附屬協(xié)和醫(yī)院（王學瑩，宋典坤）