復方大黃膏抗炎鎮痛作用研究

金 照陳智耶袁玉青鄭艷艷王 辰金可可

復方大黃膏抗炎鎮痛作用研究

金 照1陳智耶1袁玉青1鄭艷艷1王 辰1金可可2

小鼠；復方大黃膏；抗炎；鎮痛；炎癥介質

復方大黃膏為肛腸科外用藥,具有止痛、消腫、止血等功效。本實驗對該藥物的抗炎鎮痛作用及其機制進行研究，并與馬應龍麝香痔瘡膏作對照，為進一步開發該藥提供實驗依據。

1 材 料

1.1 動 物 選用8周齡健康雄性ICR小鼠，合格證書:SYXK（浙）2015-0009，體質量（25±5）g，由溫州醫科大學實驗動物中心提供，給予顆粒飼料喂養，自由飲水。

1.2 藥品和試劑 復方大黃膏成分為大黃、白芨、三七、甘草，由溫州市中西醫結合醫院中藥制劑室制備。腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白細胞介素-1β （IL-1β）Ⅰ抗購自Santa Cruz，Ⅱ抗購自武漢安特捷生物技術有限公司，其它試劑為進口分裝或國產分析純。

2 方 法

2.1 消腫實驗 采用二甲苯致小鼠耳廓腫脹法。雄性50只隨機均分為復方大黃膏高、中、低劑量組（分別以5g/kg、2.5g/kg、1.25g/kg的藥物外用）、馬應龍麝香痔瘡膏組（2.5g/kg）、賦形劑對照組（復方大黃膏賦形劑凡士林2.5g/kg）。二甲苯0.05mL均勻涂于小鼠右耳前、后兩面致炎，1h后各實驗組小鼠致炎耳廓上再分別均勻涂以相應藥物或賦形劑，4h后將小鼠頸椎脫位致死，沿耳廓基線用直徑8mm打孔器在左右兩耳同一部位打下雙耳片，分析天平上稱重，求兩耳片重量之差。按以下公式計算腫脹度和抑制率:腫脹度（%）=（右耳重-左耳重）/左耳重×100%，抑制率（%）=［（對照組腫脹度均數-用藥組腫脹度均數）/對照組腫脹度均數］×100%。

2.2 鎮痛實驗 采用熱板法及醋酸扭體法。熱板法:恒溫器水溫調節至（55±0.5）℃，將500mL燒杯放入其中，燒杯底部接觸水面。每次取小鼠1只，放入燒杯內。記錄自放入燒杯至出現舔后腳所需時間（s），作為該鼠的痛閾值。如30s內不出現舔后足者，則棄之不用。依次測量各小鼠的痛閾值，預選合格小鼠100只，隨機分為五組，組別同消腫實驗，重新測痛閾1次。將兩次痛閾的平均值作為該鼠給藥前的痛閾值。然后各組均灌胃給藥（劑量同消腫實驗），給藥后30、60、120min分別測定各小鼠痛閾值。若60s仍無反應，即取出，其痛閾按60s計算。醋酸扭體法:動物、分組、給藥同熱板法。取0.6%醋酸溶液，按0.1mL/10g劑量，腹腔注射，觀察15min內各動物出現扭體反應的次數。

2.3 抗炎實驗 采用蛋白印跡法（Western blotting）檢測組織腫瘤壞死因子（TNF-α）和白介素-1β（IL-1β）蛋白的表達。取上述2.1中各組的右耳組織于-70℃儲存備用。全細胞裂解液提取總蛋白，BCA法測定總蛋白濃度，SDS-PAGE電泳分離蛋白后轉移到PVDF膜上，5%的脫脂奶粉封閉1h，Ⅰ抗4℃孵育過夜。Ⅱ抗室溫孵育2h后ECL發光，暗室中曝光、顯影、定影。Quantity One凝膠軟件分析系統分析蛋白條帶的光密度值，以GAPDH為內參照進行蛋白定量。

2.4 統計學方法 應用SPSS17.0統計軟件分析。所有數據進行正態性檢驗，用（±s）表示。多組樣本均數比較采用方差齊性檢驗，組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA）。方差齊性者兩兩比較采用LSD法，方差不齊者則進行Dunnet’s T3檢驗。

3 結果

3.1 對二甲苯致小鼠耳廓腫脹的影響 與賦形劑對照組比較，復方大黃膏低、中、高劑量組耳腫脹度均顯著減輕，差異有統計學意義（孕＜0.05或孕＜0.01），抑制率以高劑量組最為明顯，顯示良好的量效關系，見表1。

表1 復方大黃膏對二甲苯所致小鼠耳腫脹度的影響（%，±s）

表1 復方大黃膏對二甲苯所致小鼠耳腫脹度的影響（%，±s）

注:與賦形劑對照組比較，*孕＜0.05，**孕＜0.01

組別賦形劑對照組復方大黃膏低劑量組復方大黃膏中劑量組復方大黃膏高劑量組馬應龍麝香痔瘡膏組鼠數10 10 10 10 10腫脹度111.24±20.21 88.45±19.31* 80.33±16.41** 71.91±13.29** 81.70±15.52**抑制率0 20.49 27.79 35.36 26.56

3.2 對小鼠熱板法致痛和醋酸扭體反應的影響 熱板法結果顯示，與賦形劑對照組比較，復方大黃膏中、高劑量組均明顯提高用藥后30、60、120min小鼠的痛閾值，復方大黃膏低劑量組可明顯提高用藥后30、60min小鼠的痛閾值，差異有統計學意義（孕＜0.05），見表2。醋酸扭體法結果顯示，與賦形劑對照組的（32.46±7.64）次比較，復方大黃膏中、高劑量組扭體次數分別為（19.48±6.02）次、（15.22±6.60）次，均明顯減少，差異有統計學意義（孕＜0.01）。提示復方大黃膏具有良好的鎮痛作用。

3.3 對 TNF-α和 IL-1β表達的影響 Western blotting結果顯示，與賦形劑對照組比較，復方大黃膏低、中、高劑量組TNF-α和IL-1β蛋白表達均明顯降低（孕＜0.05），且高劑量組與低、中劑量組比較，差異有統計學意義（孕＜0.05），見圖1。提示復方大黃膏對炎癥介質表達具有明顯的抑制作用。

表2 復方大黃膏對小鼠熱板致痛作用實驗結果（s±s）

表2 復方大黃膏對小鼠熱板致痛作用實驗結果（s±s）

注:與賦形劑對照組比較，*孕＜0.05

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4 討論

由于肛門部解剖學和生理學特點決定肛門部疾病容易感染，發作時疼痛明顯，術后愈合的時間長。細菌及細菌釋放內毒素的作用是引起創面愈合延緩的主要因素，內毒素不但引起創面炎性細胞浸潤，還可引起炎性細胞因子釋放，從而加重局部炎癥反應，導致創面水腫，并形成水腫肉芽，減少成纖維細胞增生及向膠原纖維轉化。TNF-α是炎癥反應過程中出現最早、最重要的炎性介質之一，能激活中性粒細胞和淋巴細胞，使血管內皮細胞通透性增加，并促使其他細胞因子的合成和釋放[1]；IL-1β是急性炎癥反應的關鍵介質，是啟動炎性反應的關鍵細胞因子之一[2]。復方大黃膏主要成分為大黃、白芨、三七、甘草，按照7：3：2：1配制。本研究發現，復方大黃膏低、中、高三個劑量組對二甲苯引起的小鼠耳廓腫脹具有明顯的抑制作用，均明顯抑制TNF-α和IL-1β蛋白的表達。提示復方大黃膏可通過抑制TNF-α和IL-1β的表達，發揮抗炎作用。

圖1 復方大黃膏對小鼠腫脹耳廓TNF-α和IL-1β蛋白表達的影響

熱板法結果顯示，復方大黃膏中、高劑量組均明顯提高用藥后30、60、120min小鼠的痛閾值，低劑量組可明顯提高用藥后30、60min小鼠的痛閾值，中、高劑量能明顯減少小鼠扭體次數，表明該藥對化學和物理刺激造成的疼痛反應均有明顯的鎮痛效果。研究發現，炎癥反應與疼痛反應有密切關系，炎癥反應使血管通透性增高，血液成分進入組織中，組織中的感覺神經受到炎癥因子的刺激，可發生疼痛反應[3]。因此，本研究中復方大黃膏緩解疼痛的作用可能也與抑制TNF-α和IL-1β等炎癥介質的釋放，從而抑制炎癥反應有關，其具體機制有待于進一步研究。

［1］Vandenbroucke RE，Dejonckheere E，Van Hauwermeiren F，et al.Matrix metalloproteinase 13 modulates intestinal epithelial barrier integrity in inflammatory diseases by activating TNF［J］.EMBO Mol Med，2013，5（7）:932-948.

［2］師偉，劉瑞芬，楊曉娜，等.活血化瘀法對慢性盆腔炎雌性大鼠血清前炎癥細胞因子TNF-α、IL-1β、IL-8水平的影響［J］.中國醫學創新，2012，9（32）:1-3.

［3］Esfahani HM，Esfahani ZN，Dehaghi NK，et al.Anti-inflammatory and anti-nociceptive effects of the ethanolic extracts of Alkanna frigida and Alkanna orientalis［J］.J Nat Med，2012，66（3）:447-452.

（收稿:2016-03-24 修回:2016-05-31）

浙江省自然科學基金項目（No.Y207495）；浙江省溫州市科技計劃項目（No.Y20130315）

1浙江省溫州市中西醫結合醫院中醫肛腸科（溫州 325000）；2溫州醫科大學（溫州 325000）

金可可，Tel:13868306996