白藜蘆醇對抗氧化型低密度脂蛋白誘導的內皮細胞損傷及其機制

過華蕾邵 暢龔儀棠陳 豪

白藜蘆醇對抗氧化型低密度脂蛋白誘導的內皮細胞損傷及其機制

過華蕾1邵 暢2龔儀棠1陳 豪1

目的探討白藜蘆醇對氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）誘導的內皮細胞損傷的保護作用及其機制。方法體外培養人臍靜脈內皮細胞，并隨機分為對照組、ox-LDL組、不同濃度（10μmol/ L、50μmol/L）白藜蘆醇保護組，通過檢測細胞活力、超氧化物歧化酶（SOD）水平、丙二醛（MDA）含量評價內皮細胞損傷程度。RT-PCR及Western blot法檢測單核細胞趨化蛋白1（MCP-1）和細胞間黏附分子1（ICAM-1）RNA和蛋白表達。結果與對照組比較，ox-LDL組細胞活力、SOD水平降低[（0.33±0.01）比（0.45±0.010），（12.8±0.31）U/mL比（15.5±0.150U/mL，P＜0.05]，MDA含量增加[（2.10± 0.51）nmol/mgprot比（1.05±0.06）nmol/mgprot，P＜0.05]，MCP-1、ICAM-1 RNA表達明顯升高（1.56± 0.06比0.67±0.09，3.62±0.32比1.35±0.21，P＜0.05）；與ox-LDL組相比，白藜蘆醇（10、50μmol/L）保護組細胞活力升高（0.38±0.02、0.39±0.02比0.33±0.01，P＜0.05）、SOD水平升高[（14.4±0.61）U/mL、（14.8±0.57）U/mL比（12.8±0.31）U/mL，P＜0.05]，MDA含量減少[（1.41±0.15）nmol/mgprot、（1.37±0.05）nmol/mgprot比（2.10±0.51）nmol/mgprot，P＜0.05]，MCP-1、ICAM-1 RNA和蛋白表達明顯降低（1.03± 0.05、0.92±0.08比1.56±0.06，1.88±0.25、1.67±0.16比3.62±0.32，P＜0.05）。結論白藜蘆醇對ox-LDL誘導的血管內皮細胞損傷有保護作用。

動脈粥樣硬化；內皮細胞損傷；白藜蘆醇；ox-LDL；氧化應激

心血管疾病是世界范圍內發病率和致死率均居首位的疾病，嚴重危害到人類健康。血管內皮損傷及功能障礙是心血管病尤其是動脈粥樣硬化發生發展的始動環節。氧化型低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein，ox-LDL）是公認的動脈粥樣硬化的獨立危險因子，參與動脈粥樣硬化發生發展的各個環節[1]。白藜蘆醇是一種存在于葡萄、虎杖、藜蘆等植物中的活性物質，具有多種生物學功能，包括抗腫瘤、延緩衰老、促腦卒中后腦功能恢復等[2-3]。對于心血管系統，也具有多重保護功能，如調節脂質代謝，抑制血小板凝集，平衡凝血纖溶系統等[4]。但白藜蘆醇對ox-LDL誘導的內皮損傷的效應尚未見報道。本研究以ox-LDL為誘導因子，作用于人臍靜脈內皮細胞，檢測細胞活力、氧化應激水平、單核細胞趨化蛋白 1（monocyte chemoattractant protein 1，MCP-1）及細胞間黏附分子1（intercellular adhesion molecule 1，ICAM-1）的表達，從細胞水平探討白藜蘆醇對ox-LDL誘導的內皮細胞損傷有無保護作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 材 料 ox-LDL購自奕源生物科技有限公司、M199培養基、青鏈霉素、0.05%胰酶、0.25%胰酶、胎牛血清、胰蛋白酶均購自美國Hyclone公司；內皮細胞生長因子（ECGS）購自美國BD公司；白藜蘆醇、噻唑藍（MTT）購自美國Sigma公司；超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）測定試劑盒、細胞丙二醛（Malondialdehyde，MDA）測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所。單克隆小鼠β-actin抗體、MCP-1、ICAM-1抗體購自CST公司。抗鼠及抗兔的連接辣根過氧化物酶的IgG（H+L）購自美國Vector公司，超敏發光液（enhanced chemiluminescence，ECL）為普利萊基因技術有限公司產品。逆轉錄試劑盒、Realtime PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司，Trizol購自美國Invitrogen公司。

1.2 細胞培養 在無菌條件下取新生兒臍帶（長度＞20cm），將剪成鈍端的注射針頭插入臍靜脈內，用PBS沖洗掉管腔內殘留的血凝塊，再用0.25%胰酶注入靜脈腔，充分消化靜脈內皮8min后將松開止血鉗，使消化液流入預先放有1mL血清的15mL離心管中，1000r/min離心7min后可見離心管底部有白色的細胞團塊，棄去上清后用完全培養液懸浮細胞，輕輕吹打混勻，置于37℃、5%CO2的培養箱中。培養24h換液，至細胞融合90%以上時用0.05%胰酶消化傳代，第2～5代用于實驗。

1.3 實驗分組 取第2～5代人臍靜脈內皮細胞（HUVECs）鋪96孔板，每組6個復孔。實驗分為正常對照組、100mg/L ox-LDL處理24h誘導的內皮細胞損傷模型組、ox-LDL加不同劑量白藜蘆醇（10、50μmol/L）處理24h的保護組。

1.4 MTT法測定細胞活力 待細胞貼壁后按實驗分組加入相應藥物處理24h。每孔避光加入5g/L的MTT 20μL后置于37℃、5%的CO2培養箱中孵育4h。棄去上清液，每孔加入150μL DMSO，振蕩器振蕩10min，使結晶充分溶解。采用酶標儀測定各孔OD（560nm）值。

1.5 細胞外液SOD水平、細胞中MDA含量測定待細胞貼壁后按實驗分組加入相應藥物處理24h。將培養液移入1.5mL EP管中，3000r/min離心10min，取上清。按照SOD檢測試劑盒（WST-1法）操作說明檢測細胞外液SOD活力。將貼壁生長的HUVECs用細胞刮刮下，按照細胞丙二醛（MDA）測定試劑盒操作說明檢測細胞中MDA含量。

1.6 實時熒光定量PCR 按Trizol總RNA提取試劑說明，提取內皮細胞總RNA，并測定其濃度和純度。取500ng總RNA用于cDNA合成，采用TaKaRa逆轉錄試劑盒，按照說明操作。逆轉錄引物序列如下：MCP-1（forward）：5’-CTGCCCTCCTGTGCCTGCTAC-3’，MCP-1（reverse）：5’-ATTCTTGGGTTGTGGAGTGAGTGC-3’；ICAM-1（forward）：5’-AACTCT CCAGAACACCTCG-3’，ICAM-1（reverse）：5’-AGCA CCAGGTAGACCTTAGC-3’；β-actin（forward）：5’-AACCGCGAGAAGATGACCCAGATCATGTTT-3’，βactin（reverse）：5’-AGCAGCCGTGGCCATCTCTTGCT CGAAGTC-3’。合成的cDNA用于實時定量PCR反應，采用TaKaRa熒光定量PCR試劑盒，按照說明書進行操作。步驟一預變性：95℃ 30s；步驟二兩步法擴增：95℃ 5s，60℃ 20s，40個循環；步驟三溶解曲線：95℃ 0s，65℃ 15s，95℃ 0s。MCP-1和ICAM-1的表達量，通過與β-actin CT值的均數的比值來表示。

1.7 Western blotting檢測 將每組蛋白按照總量80μg計算出上樣體積，加入蛋白上樣緩沖液，經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，轉移至PVDF膜。脫脂奶粉封閉1h，然后4℃一抗搖床孵育過夜。TBST洗3次，每次10min，然后與二抗孵育1h。TBST洗3遍后顯影。

1.8 統計學方法 各項實驗都至少重復3次。應用SPSS16.0統計軟件處理統計資料。計量資料以均數±標準差（±s）表示，采用單因素方差分析（one-way ANOVA）和LSD-test檢驗進行均數的兩兩比較。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組細胞活力、SOD水平、MDA含量比較 與對照組相比，ox-LDL組HUVECs細胞活力明顯降低，SOD水平明顯下降，MDA含量明顯增多（P＜0.05）；加入白藜蘆醇（10、50μmol/L）的保護組，細胞活力明顯升高，SOD水平明顯升高，MDA含量明顯減少，與ox-LDL組比較差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 各組細胞活力、SOD水平、MDA含量比較（±s）

表1 各組細胞活力、SOD水平、MDA含量比較（±s）

注：與正常對照組比較，*P＜0.05；與ox-LDL組比較，#P＜0.05；保護1組：ox-LDL+10μmol/L RESV；保護2組：ox-LDL+50μmol/L RESV

組別正常對照組ox-LDL組保護1組保護2組孔數6 6 6 6細胞活力0.45±0.01 0.33±0.01* 0.38±0.02#0.39±0.02#SOD（U/mL）15.5±0.15 12.8±0.31* 14.4±0.61#14.8±0.57#MDA（nmol/mgprot）1.05±0.06 2.10±0.51* 1.41±0.15#1.37±0.05#

2.2 各組MCP-1和ICAM-1 RNA水平比較 與對照組相比，ox-LDL組MCP-1、ICAM-1 RNA表達水平明顯升高（P＜0.05），加入白藜蘆醇（10、50μmol/L）的保護組，MCP-1、ICAM-1 RNA表達水平明顯降低，與ox-LDL組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 各組MCP-1和ICAM-1 RNA水平比較（±s）

表2 各組MCP-1和ICAM-1 RNA水平比較（±s）

注：與正常對照組比較，*P＜0.05；與ox-LDL組比較，#P＜0.05；保護1組：ox-LDL+10μmol/L RESV；保護2組：ox-LDL+50μmol/L RESV

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2.3 各組MCP-1和ICAM-1蛋白表達比較 與對照組比較，ox-LDL組MCP-1、ICAM-1蛋白表達明顯升高，而加入白藜蘆醇（10、50μmol/L）的保護組，MCP-1、ICAM-1蛋白表達水平明顯降低，見圖1。

3 討 論

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病及心肌梗死的發病與脂質代謝異常密切相關，特別是氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）是公認的動脈粥樣硬化的獨立危險因子，參與動脈粥樣硬化發展的各個環節[5]。血管內皮在調節血管舒縮、凝血及纖溶，對抗氧自由基損傷等方面起到重要的作用。血管內皮損傷是心血管疾病的始動環節，而血管內皮對ox-LDL誘導的氧化損傷非常敏感。

圖1 各組MCP-1和ICAM-1蛋白表達的比較

超氧化物歧化酶（SOD）能清除細胞中過多的氧自由基，其活力高低可間接反映細胞清除氧自由基的能力；丙二醛（MDA）是自由基損傷不飽和脂肪酸生成的中間產物，其含量能間接證明細胞內自由基的水平[6]。細胞內自由基產生增多，而清除自由基的相關酶活性下降，是細胞損傷壞死的重要機制。本實驗結果表明ox-LDL作用可使細胞抗氧化能力降低，細胞內自由基含量升高。白藜蘆醇可以對抗ox-LDL處理產生的效應，提高細胞外SOD水平，降低細胞內MDA含量。

MCP-1和ICAM-1在動脈粥樣硬化的早期病灶中已有表達，主要是促單核細胞向內皮黏附、遷移。巨噬細胞吞噬ox-LDL形成泡沫細胞，導致MCP-1、ICAM-1表達升高[7]。ox-LDL促血小板聚集、單核細胞黏附，促內皮細胞凋亡。本研究發現，與對照組相比，ox-LDL可以明顯降低細胞活力，使MCP-1、ICAM-1 RNA與蛋白表達顯著提高，而白藜蘆醇可以增加細胞活力，同時使MCP-1、ICAM-1 RNA與蛋白表達降低。

白藜蘆醇主要通過減少血小板聚集，促血管舒張，減少脂質過氧化反應，調節血膽固醇和甘油三酯水平來防治心血管疾病[8-9]。本研究結果顯示，白藜蘆醇的保護效應可能是因為其良好的抗氧化作用改善了細胞的氧化應激狀態，提高細胞的抗氧化能力所致。同時它還降低內皮細胞MCP-1、ICAM-1的表達。

綜上所述，白藜蘆醇可以適度調控內皮細胞氧化應激水平，抑制ox-LDL誘導的內皮細胞趨化和黏附反應，在早期環節改善內皮細胞功能、活力，抑制ox-LDL對內皮的損傷，阻斷中、晚期斑塊的病理過程。

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（收稿：2016-01-26 修回：2016-03-14）

Protective Effect of Resveratrol on Endothelial Injury Induced by OxidizedLow Density Lipoprotein and the Involved Mechanism

GUO Hualei1,SHAO Chang2,GONG Yitang1,CHEN Hao11 Department of Pathology, Hangzhou Maternity Hospital,Hangzhou（310008）,China;2 Department of Pathology,Hangzhou First People's Hospital,Hangzhou（310006）,China

ObjectiveTo investigate the effect of resveratrol on endothelial injury induced by oxidized low density lipoprotein（ox-LDL）and its mechanism.MethodsIn vitro cultured human umbilical vein endothelial cells were randomly divided into control group,ox-LDL group,protective groups added different concentrations（10μmol/L and 50μmol/L）of resveratrol.Cell viability,superoxide dismutase（SOD）level and malondialdehyde（MDA）content were detected to evaluate the damage of endothelial cells.Expression of monocyte chemoattractant protein l（MCP-1）and intercellular adhesion molecule 1（ICAM-1）in RNA and protein level were detected by RT-PCR and Western blot,respectively.ResultsCompared to control group,cell viability（0.33±0.01 vs 0.45±0.01）and SOD level（12.8±0.31U/mL vs 15.5±0.150U/mL）decreased while MDA content increased（2.10±0.51nmol/mgprot vs 1.05± 0.06nmol/mgprot）,expression of MCP-1（1.56±0.06 vs 0.67±0.09）and ICAM-1（3.62±0.32 vs 1.35±0.21）in RNA levelincreased significantly（all P＜0.05）in ox-LDL group.Compared to ox-LDL group,protective groups had increased cell viability（0.38±0.02,0.39±0.02 vs 0.33±0.01）and SOD level（14.4±0.61U/mL,14.8±0.57U/mL vs 12.8± 0.31U/mL）and decreased MDA content（1.41±0.15nmol/mgprot,1.37±0.05nmol/mgprot vs 2.10±0.51nmol/mgprot）, decreased expression of MCP-1（1.03±0.05,0.92±0.08 vs 1.56±0.06）and ICAM-1（1.88±0.25,1.67±0.16 vs 3.62± 0.32）in RNA and protein level（all P＜0.05）.ConclusionResveratrol can protect vascular endothelial cells against ox-LDL-induced injury.

resveratrol;ox-LDL;oxidative stress;atherosclerosis

1杭州市婦產科醫院病理科（杭州 310008）；2杭州市第一人民醫院病理科（杭州 310006）

過華蕾，E-mail：jane_123@163.com