山楂總黃酮對人肝細胞低密度脂蛋白受體表達的影響

黃曉黎 陳益民 駱 豐

山楂總黃酮對人肝細胞低密度脂蛋白受體表達的影響

黃曉黎 陳益民 駱 豐

目的觀察山楂總黃酮對人肝細胞（HePG2）低密度脂蛋白受體表達的影響。方法用MTT法篩選出合適的山楂總黃酮作用濃度，用含不同濃度的山楂總黃酮培養液培養人肝細胞，基于細胞免疫技術，用熒光顯微鏡結合流式細胞術測定人肝細胞膜低密度脂蛋白受體的表達量和表達活性。結果隨著山楂總黃酮濃度升高，人肝細胞低密度脂蛋白受體的表達量和表達活性增加。5、15、25μmol/L的山楂總黃酮在每10 000個人肝細胞中的肝細胞膜低密度脂蛋白受體表達量的平均熒光強度分別為11.21、14.39、19.67；每10 000個人肝細胞中的肝細胞膜低密度脂蛋白受體表達活性分別為6.34、10.11、16.77。結論山楂總黃酮能顯著增加人肝細胞膜低密度脂蛋白受體的表達。

山楂總黃酮；人肝細胞；低密度脂蛋白受體；細胞免疫；流式細胞術

低密度脂蛋白（LDL）是膽固醇在人體血清中的主要存在形式，低密度脂蛋白濃度異常升高是造成冠狀動脈粥樣硬化的主要原因之一。位于肝細胞膜上的LDL受體通過受體介導的內吞作用能夠吸收和降解血漿中的低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C），因此LDL受體在調節低密度脂蛋白代謝和維持血漿膽固醇平衡方面起著非常重要的作用[1]。研究[2]表明，從山楂葉中提取的山楂總黃酮，具有明顯的降膽固醇作用。人肝細胞（HePG2）LDL受體含量豐富，山楂總黃酮對人肝細胞（HePG2）的LDL受體表達的影響尚未見報道。本實驗通過研究山楂總黃酮對HePG2的LDL受體表達的影響，探討山楂總黃酮的調脂作用部位和機制，闡明山楂總黃酮的作用靶點。

1 材料與儀器

1.1 材料及試劑 HePG2：中科院上海細胞庫提供；山楂總黃酮標準品（純度≥98%）：購自安徽甙爾塔天然有機化合物信息中心，批號20130520?？贵w：一抗：兔抗牛LDLR-IgG（浙江中醫藥大學生命科學學院制備），二抗：羊抗兔IgG-FITC（晶美生物工程公司）。DIL-LDL（浙江中醫藥大學制備）。

1.2 儀器及耗材 SW-CJ-IF層流超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司），CO2培養箱（Heraeus），LDZ5-2型低速臺式離心機（北京醫用離心機廠），臺式微量高速離心機（Heraeus），倒置顯微鏡（XDS-1B，COIC），熒光顯微鏡（德國Leica公司），Labsystems Dragon Wellscan MK-3型全自動多功能型酶標儀（Thermo Labsystems），流式細胞儀（Coulter EPICS RXL）。

2 方法

2.1 MTT法測定山楂總黃酮測定對HePG2細胞增殖的影響 以山楂總黃酮濃度梯度0、5、15、25、30、35、40μmol/L分7組，每組5個復孔。選擇對數生長期的細胞HePG2，接種于96孔板；按照分組加入相應濃度的山楂總黃酮；空白組只加培養液。每孔加入5mg/mL MTT溶液，在波長為570nm處檢測每孔吸光度（A），根據（A）判定藥物對細胞增殖的影響。

2.2 LDL受體表達活性檢測 設山楂總黃酮0、5、15、25μmol/L 4個濃度組，選擇對數生長期的細胞HePG2，接種于96孔板；按分組加入山楂總黃酮，使其終濃度分別達到0、5、15、25μmol/L；收集細胞后加入DIL-LDL孵育；采用流式細胞術檢測。

2.3 LDL受體表達量的檢測 設山楂總黃酮0、5、15、25umol/L 4個濃度組，選擇對數生長期的細胞HePG2，接種于96孔板；按分組加入山楂總黃酮，使其終濃度分別達到0、5、15、25μmol/L；一抗孵育：將細胞收集清洗后加入兔抗牛LDLR IgG，孵育2h；二抗孵育：將細胞收集清洗加入羊抗兔IgG-FITC，繼續孵育2h；采用流式細胞術檢測。

2.4 統計學方法 應用Excel統計工具分析，對MTT的結果進行統計，數據以均值±標準差（±s） 表示，采用t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 山楂總黃酮對人肝細胞增殖的影響 MTT結果顯示，0～30μmol/L的山楂總黃酮對人肝細胞的增殖影響差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 山楂總黃酮對人肝細胞增殖的影響（±s）

表1 山楂總黃酮對人肝細胞增殖的影響（±s）

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3.2 山楂總黃酮對人肝細胞HePG2 LDL受體表達活性的影響 因0～30μmol/L的山楂總黃酮對人肝細胞增殖影響差異無統計學意義（P＞0.05），故選擇5、15、25μmol/L三個濃度。隨著山楂總黃酮以0、5、15、25μmol/L濃度遞增，其平均熒光強度也隨著逐漸增大，分別為3.11、6.34、10.11、16.77，表明HePG2 LDL受體表達活性隨著山楂總黃酮濃度的提高而增強。見圖1（封四）。

3.3 山楂總黃酮對人肝細胞HePG2 LDL受體表達量的影響 隨著山楂總黃酮0、5、15、25μmol/L濃度的增高，其平均熒光強度也隨著逐漸增大，分別為6.11、11.21、14.39、19.67，表明HePG2 LDL受體表達量隨著山楂總黃酮濃度的提高而增加。見圖2（封四）。

4 討 論

研究[2]表明，從山楂葉中提取的山楂總黃酮，具有明顯的降低膽固醇和甘油三酯作用。但至今較少從細胞和分子水平作研究。本實驗通過分析山楂總黃酮對人肝癌細胞HePG2 LDL受體表達的影響，研究其降脂作用部位和作用機制。

MTT法是一種準確、簡便、快速的測定細胞增殖與抑制的方法。本實驗通過MTT法檢測0～40μmol/L的山楂總黃酮溶液對細胞增殖的影響。結果顯示，山楂總黃酮溶液濃度在0～30μmol/L范圍內山楂總黃酮溶液對人肝細胞增殖的影響差異無統計學意義（P＞0.05），說明對HePG2細胞生長基本沒有影響。故本實驗選擇5、15、25μmol/L三個藥物濃度。

熒光顯微鏡和流式細胞術結果表明，隨著15～25μmol/L濃度的增加，山楂總黃酮溶液能顯著增加HePG2 LDL受體的表達活性。通過檢測抗體表達量而間接測定受體表達量，15～25μmol/L的山楂總黃酮溶液能顯著增加HePG2 LDL受體的表達量，顯示隨著山楂總黃酮濃度的增高，受體表達總量增多。綜上，15～25μmol/L的山楂總黃酮溶液能顯著增加HePG2 LDL受體的表達。由于LDL受體表達受又多種信號調控通路的影響（SREBP途徑，ERK途徑）[3-4]，對于其分子機制有待進一步研究。

［1］李月琴，張淑華.中國漢族人群LDL受體基因Nco I多態性及其與血清高膽固醇的相關性研究［J］.中華醫學遺傳學雜志，2001，18（5）：406-407.

［2］王玲，吳軍林，吳清平，等.山楂降血脂作用和機理研究進展［J］.食品科學，2015，36（15）：245-248.

［3］Wang YG，Yang TL.Liraglutide reduces oxidized LDL-inducedoxidative stress and fatty degeneration in Raw 264.7 cells involving the AMPK/SREBP1 pathway［J］.老年心臟病學雜志（英文版），2015，12（4）：410-416.

［4］Yu XH，Li XX，Zhao GJ，et al.MoOxLDL up-regulates Niemann-Pick type C1 expression through ERK1/2/COX-2/ PPARα-signaling pathway in macrophages［J］.生物化學與生物物理學報（英文版），2012，44（2）：119-128.

（收稿：2016-02-13 修回：2016-04-20）

Effect of Hawthorn Flavones on HePG2 Low-density Lipoprotein Receptors

HUANG Xiaoli,CHEN Yimin,LUO Feng Department of Clinical Laboratory,Zhejiang Chinese Medical Hospital,Hangzhou(310000),China

ObjectiveTo investigate the expression of HepG2 low-density lipoprotein（LDL）receptor affected by hawthorn flavones.MethodsMTT method was used to screen appropriate hawthorn flavone concentrations for culture of the HePG2 line.The numbers and activity of LDL receptorwere measured by cell immunity technology and flow cytometer technology.ResultsWith the increase in concentration of hawthorn flavones,the expression and activity of HepG2LDL receptorincreased.With 5-25 μmol/L amount of hawthorn flavone,the geometric mean of fluorescenevalue of LDL receptors on 10000 HepG2cellswas11.21,14.39,19.67 and the activity valuewas 6.34,10.11,16.77,respectively.ConclusionHawthorn flavones can up-regulate the expression of LDL receptorson HepG2.

hawthorn flavones;HepG2;lower-density lipoprotein receptor;cell immunity;flow cytometry

浙江省中醫院檢驗科（杭州 310000）

黃曉黎，Tel：13758253131；E-mail：huangxiaoli8676@163.com