豬偽狂犬病毒gB基因序列分析

陳如敬，周倫江，吳學敏，黃曉鳳,車勇良，嚴 山，王晨燕，王隆柏，劉玉濤，魏 宏

(福建省農業科學院畜牧獸醫研究所/福建省畜禽疫病防治工程技術研究中心，福建 福州 350013)

豬偽狂犬病毒gB基因序列分析

陳如敬，周倫江*，吳學敏，黃曉鳳,車勇良，嚴 山，王晨燕，王隆柏，劉玉濤，魏 宏

(福建省農業科學院畜牧獸醫研究所/福建省畜禽疫病防治工程技術研究中心，福建 福州 350013)

2011年以來我國多省免疫豬偽狂犬病毒gE基因缺失苗豬場出現變異型豬偽狂犬病毒(PRV)感染，經典豬偽狂犬病毒疫苗(Bartha-k61)對該病無法提供100%有效保護，已有研究發現變異型PRV和經典PRVgE基因存在特征性變異。為明確變異型PRVgB基因特征，本研究對GenBank中登錄的部分PRV代表株gB基因進行分析比較。結果表明，我國經典型和變異型PRV在gB蛋白氨基酸編碼區第395位、453位、562位和739位存在特征性差異，但不同來源PRVgB基因的核苷酸和氨基酸同源性分別在98.1%～100%和96.1%～100%。從相互之間的遺傳進化關系可以看出，PRV遺傳進化出現兩個大的遺傳分支，呈現明顯的地域性。新發變異型和經典型PRV在中國PRV遺傳進化分支上呈現各自獨立進化小分支；我國近年分離的貉源和約克夏梗犬源與新發變異型PRV則處于同一進化小分支。

豬偽狂犬病毒；gB基因；序列分析

偽狂犬病毒(pseudorabies virus，PRV)屬于皰疹病毒科Herpesviridae、α-皰疹病毒亞科Alphaherpesvirinae、水痘病毒屬Varicellovirus。偽狂犬病毒能感染多種宿主，并伴有典型的神經癥狀，常被作為病毒神經生物學研究的理想模型[1-2]。

豬是偽狂犬病毒的天然宿主，感染后主要引起母豬流產死胎、新生仔豬死亡，并伴隨有對機體免疫系統的損傷。PRV 基因組全長約150 kb，其基因組 GC含量高達 70.0%以上，共編碼100多種蛋白。目前PRV研究主要集中在gB、gC、gD、gE、gG、gH、gI、gK、gL、gM和gN等[3-4]。gB基因是PRV中較為保守的必需糖蛋白，可促進病毒囊膜與宿主細胞膜融合，并可誘導中和抗體的產生[5-7]。自2011年以來，我國多省市使用gE基因缺失苗(Bartha-k61株)的豬場相繼爆發豬偽狂犬疫情，研究發現其和經典PRV存在毒力和抗原性變異。對變異型PRVgE基因進行研究發現，其142～144位存在連續3個堿基(GAC)特征性插入[4,8-11]。但目前對于gB基因特征還未見相關研究，為明確不同類型PRVgB基因特征，本研究通過對GenBank數據庫中PRV代表株進行gB基因特征分析，為明確變異型PRVgB基因特征、追溯變異型PRV來源，科學認知和防控PRV提供借鑒和參考。

1 材料與方法

1.1 毒株來源

本研究通過對NCBI數據庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中登錄的PRV分離株進行分析，選取國外野豬和家豬源PRV分離株、疫苗株(Becker株和Bartha株)、我國PRV經典代表株(Ea株)、2011年變異型PRV暴發前分離的PRV毒株(HN-HK株、GX-NL和HYYD-China-2008)與2011年后PRV分離株，以及我國今年分離報道的犬源PRV(BJ/YT株)和貉源PRV(Rang株)的gB基因來進行分析研究。本研究使用的PRV分離株gB基因相關序列信息見表1。

1.2 基因序列分析

1.2.1 核苷酸同源性比較 根據分子生物學分析軟件DNAStar對表1中PRV株gB基因核苷酸序列進行核苷酸分析比對，尋找不同類型PRV分離株的特征性變異區。

1.2.2 氨基酸同源性比較 將表1中PRV株gB基因核苷酸序列推導出氨基酸序列，對其進行氨基酸特征性變異區分析比較。

1.2.3 遺傳進化分析 利用遺傳進化分析軟件MEGA，對不同類型的PRV分離株gB基因編碼的氨基酸序列進行分析比對后，繪制相互之間的遺傳進化樹。遺傳進化分析時，采用鄰近連接法(Neigbor-Joining Methods)，重復計算(Bootstrap)1 000次。

表1 本研究使用的毒株序列信息Table 1 Information on viruses studied

2 結果與分析

2.1 PRV gB基因差異區分析

2.1.1 核苷酸特征 對我國和國外(歐洲源和韓國源)PRV分離株gB基因進行核苷酸序列分析發現：我國PRV在第223～233位存在缺失(AGCCCCGGCCT)，但國外PRV則在第279～281位存在缺失(CGG)；我國和國外(歐洲源和韓國源)PRV在第207～208位、第215～217位、第240～241位、第245位、第247位、第260位、第285～286位、第289位和第306位存在特征地區性差異，結果見圖1。

2.1.2 氨基酸特征 從氨基酸序列信息可以看出，我國和國外(歐洲源和韓國源)PRV分離株發現，第72～77位歐洲源和韓國源的PRV 均為PVPGSPGLT(但Becker株和中國株相同)，而中國分離株PRV(不論時間)均為PGTG***AT，此外，還存在多個相對獨立的特征性氨基酸變異位點，具體結果見圖2。

2.1.3 經典型和變異型中國PRV分離株氨基酸特征 從gB基因編碼的氨基酸序列信息可以看出(僅比對有特征性的區域位點)，經典型和變異型中國分離PRV株gB基因在第395位、453位、562位和739位存在差異，結果見表2。

2.2 PRV gB基因序列分析比較

2.2.1 核苷酸同源性比較 從核苷酸同源性可以看出，選取的PRV代表株gB基因核苷酸同源性均較高，在98.1%～100%。歐洲源和韓國源PRV代表株gB基因核苷酸同源性在99.1%以上；中國分離株(經典型和變異型)gB基因核苷酸同源性均在99.6%以上，且與貉源和約克夏梗犬源PRV代表株gB基因核苷酸同源性在99.5%以上，具體見圖3。

表2 我國經典型和變異型PRV株氨基酸變異區Table 2 Regions with variations on amino acids in gB genes from typical and variant PRVs

2.2.2 氨基酸同源性比較 從氨基酸同源性可以看出，選取的PRV代表株gB基因編碼的氨基酸同源性較高，均在96.1%以上。歐洲源和韓國源的PRV代表株gB基因編碼的氨基酸同源性在98.1%以上；中國分離株(經典型和變異型)代表株gB基因編碼的氨基酸同源性在99.1%以上，與貉源和約克夏梗犬源PRV代表株gB基因編碼的氨基酸同源性也在98.4%以上，具體結果見圖4。

2.3 遺傳進化分析

利用MEGA繪制PRV不同代表株gB基因編碼的氨基酸相關質檢的遺傳進化關系，從圖5可以看出，PRV代表株根據毒株分離來源差異可以分為兩個大的分支：國外(歐洲源和韓國源)PRV代表株(▲在前面)處于分支Ⅱ，我國PRV代表株(經典型和變異型)均處于分支Ⅰ。從遺傳進化分支Ⅰ可以看出，我國PRV代表株(經典型和變異型)呈現各自獨立的遺傳進化分支，其中我國PRV經典型代表株(◆在前面)處于Ⅰb分支，變異型PRV都處于Ⅰa分支。此外，我國近年分離的貉源和約克夏梗犬源PRV(★在前面)也處于相同的遺傳進化Ⅰa分支。

3 討論與結論

由于PRV疫苗的廣泛使用，世界范圍內許多國家的PRV疫情均得到有效控制或根除。但是，自2011年以來，我國多省免疫過豬偽狂犬病毒gE基因缺失苗(Bartha-k61株)的豬群均出現PRV疫情，血清學檢測見有PRV gE抗體陽性，且分離的PRV均見有gE基因片段擴增。進行進一步研究發現，經典Bartha疫苗并不能對新發PRV感染提供100%保護，新發PRV表現出毒力變強和抗原性變異[9]。對gE基因分析發現，新發變異型PRV的gE基因在48位和492位存在天冬氨酸的插入[4,8]。本研究通過對PRV相關毒株的gB基因分析發現，變異型PRV和經典型PRV在395位、562位和739位氨基酸存在差異，由于gB基因極為保守，該變異型PRV的生物學功能還有待進一步明確。

通過對PRV不同來源代表株gB基因分析可以看出，PRV在遺傳進化上出現明顯的地域性，可根據PRV毒株的分離地分為兩個大的遺傳進化分支：中國分支和國外分支。對PRV中國分支進一步研究發現，PRV近年分離株(變異型PRV)在遺傳進化上和經典型PRV分離株在遺傳進化上呈現各自獨立的遺傳進化亞分支。但是，貉源和約克夏梗犬源PRV在遺傳進化上也均處于變異型PRV遺傳進化亞分支，到底貉源和約克夏梗犬源PRV在本次PRV疫情是否存在某種關聯，變異型PRV是否來自其他源動物，還是其他動物源PRV感染來自變異型PRV感染豬群還需要更多的分子流行病學數據分析。

變異型PRV自爆發以來，國內多家單位對針對變異型PRV的疫苗進行大量的研究，通過對變異型PRV的gE/gI/TK多基因缺失苗、gE單基因缺失苗、gE/gI雙基因缺失苗等均見有可有效保護變異型PRV對豬群的侵襲[15-20]。但是，究竟是什么原因導致變異型PRV逃避經典Bartha疫苗免疫而發病，仍然是我們在研發新PRV疫苗時需要考慮的問題，新PRV疫苗在使用過程中對PRV進化存在何種影響也還需臨床數據進行明確。此外，究竟其他動物是否應該免疫PRV疫苗，其他動物對PRV(經典型和變異型)是否存在差異，也是值得進一步研究探討。

[1]鄧仕偉，汪勇，薛春芳．我國偽狂犬病流行現狀及新特點[J].動物醫學進展，2006，27(9)：105-107.

[2]李碧，朱玲，周遠，等．偽狂犬病毒神經傳導研究[J].病毒學報，2014，30(3)：332-337.

[3]SZPARA M, TAFURI Y, PARSONS L, et al. A wide extent of inter-strain diversity in virulent and vaccine strains of alphaherpesviruses[J]. PLoS Pathog, 2011, 7 (10): e1002282.

[4]張青占．變異豬偽狂犬病毒的分離鑒定及生物學特性分析[D].北京：中國農業科學院，2013.

[5]OKAZAKI K. Proteolytic cleavage of glycoprotein B is dispensable for in vitro replication, but required for syncytium formation of pseudorabies virus[J]. J Gen Virol, 2007, 88(7): 1859-1865.

[6]DORY D, RMOND M, BVEN V, et al. Pseudorabies virus glycoprotein B can be used to carry foot and mouth disease antigens in DNA vaccination of pigs[J]. Antiviral Res, 2009, 81(3): 217-225.

[7]CURANOVIC D, ENQUIST L W. Virion-incorporated glycoprotein B mediates transneuronal spread of pseudorabies virus[J]. J Virol, 2009, 83(16): 7796-7804.

[8]彭金美，安同慶，趙鴻遠，等．豬偽狂犬病病毒新流行株的分離鑒定及抗原差異性分析[J].中國預防獸醫學報，2013，35(1)：1-4.

[9]AN T, PENG J, TIAN Z, et al. Pseudorabies virus variant in Bartha-K61-vaccinated pigs, China, 2012[J]. Emerg Infect Dis, 2013, 19(11):1749-1755.

[10]YE C, ZHANG Q, TIAN Z, et al. Genomic characterization of emergent pseudorabies virus in China reveals marked sequence divergence: Evidence for the existence of two major genotypes [J]. Virology, 2015, 483: 32-43.

[11]LUO Y, LI N, CONG X, et al. Pathogenicity and genomic characterization of a pseudorabies virus variant isolated from Bartha-K61-vaccinated swine population in China [J]. Vet Microbiol, 2014, 174 (1-2): 107-115.

[12]TOMBACZ D, SHARON D, OLAH P, et al. Strain Kaplan of Pseudorabies virus genome sequenced by PacBio Single-Molecule real-time sequencing technology[J]. Genome Announc, 2014, 2(4): e00628-14.

[13]GRIMM KS, KLUPP BG, GRANZOW H, et al. Analysis of viral and cellular factors influencing herpesvirus-induced nuclear envelope breakdown[J]. J Virol, 2012, 86(12): 6512-6521.

[14]KOO H, BAE S, CHOI J, et al. Characterization and expression of the pseudorabies virus (NYJ strain) glycoproteins in Bombyx mori cells and larvae[J]. J Asia Pac Entomol, 2011, 14 (1): 107-117.

[15]WANG C, YUAN J, QIN H, et al. A novel gE-deleted pseudorabies virus (PRV) provides rapid and complete protection from lethal challenge with the PRV variant emerging in Bartha-K61-vaccinated swine population in China [J]. Vaccine, 2014, 32(27): 3379-3385.

[16]GU Z, DONG J, WANG J, et al. A novel inactivated gE/gI deleted pseudorabies virus (PRV) vaccine completely protects pigs from an emerged variant PRV challenge [J]. Virus Res, 2015, 195: 57-63.

[17]ZHANG C, GUO L, JIA X, et al. Construction of a triple gene-deleted Chinese Pseudorabies virus variant and its efficacy study as a vaccine candidate on suckling piglets [J]. Vaccine, 2015, 33(21): 2432-2437.

[18]HU R, ZHOU Q, SONG W, et al. Novel pseudorabies virus variant with defects in TK, gE and gI protects growing pigs against lethal challenge [J]. Vaccine, 2015, 33(43): 5733-5740.

[19]WANG T, XIAO Y, YANG Q, et al. Construction of a gE-Deleted Pseudorabies Virus and Its Efficacy to the New-Emerging Variant PRV Challenge in the Form of Killed Vaccine [J]. Biomed Res Int, 2015, 2015: 684945.

[20]CONG X, LEI J, XIA S, et al. Pathogenicity and immunogenicity of a gE/gI/TK gene-deleted pseudorabies virus variant in susceptible animals [J]. Vet Microbiol, 2016, 182: 170-177.

(責任編輯：林海清)

Sequence Analysis on gB Gene from Pseudorabies Virus

CHEN Ru-jing, ZHOU Lun-jiang*, WU Xue-min, HUANG Xiao-feng, CHE Yong-liang, YAN Shan, WANG Chen-yan,WANG Long-bai, LIU Yu-tao, WEI Hong

(InstituteofAnimalHusbandryandVeterinaryMedicine,FujianAcademyofAgriculturalSciences/FujianAnimalDiseasesControlTechnologyDevelopmentCenter,Fuzhou,Fujian350013,China)

Since 2011, variant pseudorabies (PR) had occurred to the Bartha-k61 vaccinated pigs on farms in most provinces in China. The traditional Bartha-k61 vaccine could not prevent those pigs from contracting the viral disease. As a result, substantial financial losses had incurred to the porcine industry. A previous study indicated that there existed distinctive variations between the gE gene of the typical PR virus (PRV) and that of the variant PRV. For comparison, the sequence of the gB gene of the typical PRV was downloaded from GenBank. It was found that at Positions 395，453，562, and 739 they showed different characteristics, and their nucleotide homology was 98.1%-100% and amino acids 96.1%-100%. A phylogenetic analysis suggested that the viruses were from two different branches and differed significantly depending upon their geographic origins. In China, these viruses had different sub-branches. And, the variant PRV shared a same sub-branch in origin with the newly identifiedNyctereutesprocyonoidesand Yorkshire Terrier PR. The information obtained would be valuable for studying biological functions of gB as well as origin-tracing on variant PRV.

Pseudorabies virus;gBgene; sequence analysis

2016-04-01初稿；2016-05-16修改稿

陳如敬(1984-)，男，助理研究員，主要從事動物傳染病研究 *通訊作者：周倫江(1973-)，博士，研究員，主要從事動物病毒分子生物學研究(E-mail: lunjiang@163.com)

福建省科技計劃項目——省屬公益類科研院所基本科研專項(2014R1023-13、2014R1023-16)

S 852

：A

：1008-0384(2016)11-1139-06

陳如敬，周倫江，吳學敏，等.豬偽狂犬病毒gB基因序列分析[J].福建農業學報，2016，31(11)：1139-1144.

CHEN R-J，ZHOU L-J，WU X-M，et al.Sequence Analysis on gB Gene from Pseudorabies Virus[J].FujianJournalofAgriculturalSciences，2016，31(11)：1139-1144.