局部注射超聲微泡促進BMP 2在大鼠體內骨骼肌表達的研究

郭琳琦　劉亮　栗樹偉　李巖　王東

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局部注射超聲微泡促進BMP 2在大鼠體內骨骼肌表達的研究

郭琳琦劉亮栗樹偉李巖王東

【摘要】目的 分析局部注射超聲微泡對BMP 2在大鼠體內骨骼肌中表達的促進作用。方法 將30只大鼠平均分為1組（空白對照）、2組（直接注射質粒）、3組（注射質粒目的基因＋微泡），并向三組大鼠股四頭肌中注射造影劑、生理鹽水和BNM 2-EGPF，每組再分為A、B組，于7 d、14 d分別處死大鼠，檢測BMP 2的表達狀況。結果 7 d后，3組中A組大鼠的BMP 2陽性表達率高于1組中A組大鼠和2組中A組大鼠（P＜0．05），14 d后，3組中B組大鼠的BMP 2陽性表達率高于1組中B組大鼠和2組中B組大鼠（P＜0．05）。結論 局部注射超聲微泡能夠提高BMP 2在大鼠骨骼肌中的表達含量，可為臨床治療骨折疾病提供新思路。

【關鍵詞】超聲微泡；BMP 2；骨骼肌；作用

近年來，不斷有臨床研究發現，局部注射超聲微泡能夠促進目的基因安全且有效的定向轉移，繼而能夠有效增加外源性基因表達量，在基因治療領域中發揮著重要的應用價值[1]。BMP 2（骨骼形態發生蛋白-2）是一種具有強效性的骨誘導因子，在骨折后的骨愈合過程中發揮著重要作用[2]。基于上述現狀，本次研究針對局部注射超聲微泡對BMP 2在大鼠體內骨骼肌中表達的促進作用進行了分析，旨在為臨床治療骨折疾病提供新思路，具體報道如下。

1 材料與方法

1.1實驗動物

實驗動物為30只健康雄性SD大鼠，清潔級，體重170～190 g。

1.2實驗方法

將目的基因BMP 2-EGPF導入大腸桿菌DH 5 a后進行基因擴增篩選，按照Promega提抽試劑盒說明書進行質粒提純，建立雙酶切反應體系鑒定DNA質粒，調整質粒濃度。制備微泡后將30只大鼠平均分為1組、2組和3組，1組大鼠作為空白對照組，2組大鼠直接注射質粒，3組大鼠注射目的質粒基因＋超聲微泡造影劑。然后將超聲微泡造影劑、生理鹽水和已定量轉化的BMP2-EGPF混合，注入三組大鼠股四頭肌中，注射量為30 μ，后用超聲將超聲微泡局部超聲破裂，超聲頻率設置為1 MHz，聲強設置為0.5 W/cm2，超聲探頭每次發射1 s，間斷1 s。將各組大鼠平均分為A組和B組，于7 d后處死各組大鼠中的A組大鼠，于14 d后處死各組大鼠中B組大鼠。取各組大鼠股四頭肌，使用石蠟包埋固定，冰凍肌肉組織，切片，應用免疫組化技術檢測各組大鼠股四頭肌中BMP 2的陽性表達狀況。

1.3BMP 2陽性表達判斷標準

BMP 2陽性表達時呈棕黃色，為顆粒狀。隨機性選取5個100倍視野，對每個高倍視野免疫組化染色陽性表達進行定量分析，每個視野取100個顆粒。顆粒無著色為0分，淺黃色、棕黃色、棕褐色分別為1、2、3分，0分為陰性，1分（淺黃色顆粒＜10%），2分（棕黃色顆粒11%～50%）、3分（棕褐色顆粒51%～75%）、4分（著色顆粒＞75%），任意兩者乘積≥3分即判定為陽性。

1.4統計學方法

所得數據使用統計學軟件SPSS13.0進行處理分析，計數資料用（n，%）表示，采用χ2檢驗、計量資料用（x-±s）表示，采用t檢驗，P＜0.05，差異具有統計學意義。

2　結果

2.11組中A組、2組中A組、3組中A組大鼠的BMP 2陽性表達率比較

免疫組化染色結果顯示，1組中A組5只大鼠股四頭肌中的BMP 2均呈陰性表達。2組中A組5只大鼠，2只大鼠股四頭肌中的BMP 2呈陽性表達，陽性表達率為40.0%。3組中A組4只大鼠股四頭肌中的BMP 2呈陽性表達，陽性表達率為80.0%，高于其他兩組中的A組大鼠（χ2=10.000；P=0.002，χ2=4.011；P=0.046）。2.21組中B組、2組中B組、3組中B組大鼠的BMP 2陽性表達率比較

免疫組化染色結果顯示，1組、2組、3組大鼠中B組大鼠股四頭肌的BMP 2陽性表達只數分別為1只、3只、5只，陽性表達率分別為20%、60%和100.0%。3組中B組大鼠股四頭肌的BMP 2陽性表達率高于其他兩組大鼠中的B組大鼠（χ2=6.667；P=0.010，χ2=4.577；P=0.029）。

2.31、2、3組大鼠BMP 2陽性表達率綜合比較

總結上述研究結果得出三組大鼠中，每組B組大鼠BMP 2陽性表達率均高于A組，3組中B組大鼠的BMP 2陽性表達率最高，其次為3組A組，2組B組，2組A組，1組B組，1組A組大鼠的BMP 2為陰性表達，上述指標之間存在的差異均具體統計學意義（P＜0.05）。

3 討論

機體骨體骨折后被破壞的骨質如何快速再生一直是我國臨床重點研究課題之一。BMP 2因具有獨特的性質也吸引了各國臨床的高度關注[3]。BMP 2在骨質中的高含量表達，可加快骨折患者骨體骨折端愈合，因此認為通過轉基因方式誘導BMP 2表達，有可能成為治療骨折疾病的新方法。

局部注射超聲微泡是近年來新發現的一種體內基因轉染載體，在一定條件下可將目的基因安全而有效的進行定向轉移，增加外源性基因表達量。但關于超聲微泡在基因轉染中的具體作用機制卻尚未完全明確[4]。研究學者認為[5]，在超聲作用下，微泡造影劑能夠通過不斷壓縮和膨脹形成“空化效應”，降低超聲波空化閾值，當超聲波達到一定強度時，微泡發生破裂，并將攜帶的目的基因釋放，促使目的基因進入機體細胞，增加外源性基因表達量。

我院本次研究對局部注射超聲微泡在促進大鼠骨骼肌中BMP 2表達的作用進行了分析，結果顯示3組大鼠中A組大鼠的BMP 2陽性表達率高于其他兩組大鼠中的A組大鼠，3組大鼠中B組大鼠的BMP 2陽性表達率高于其他兩組大鼠中的B組大鼠。本次研究所得結果表明局部注射超聲微泡可提高BMP 2在大鼠骨骼肌中的表達量，有助于研究學者確定利用局部注射超聲微泡進行基因治療的可行性。但由于我院本次研究使用的實驗動物樣本較少，因此所得研究結果的可靠性仍需大量臨床研究進行驗證。

參考文獻

[1] 唐遠姣，張凌燕，王磊，等． 治療性超聲介導微泡破裂促進大鼠體內肌肉基因轉染的參數優化實驗研究[J]． 四川大學學報（醫學版），2012，43（6）：930-935．

[2] 白園園，修建成，劉伊麗，等． 超聲空化微泡效應促進缺血骨骼肌血管新生的機制[J]． 實用醫學雜志，2014，9（15）：2367-2370．

[3] 崔海，徐亞麗，吳盛正，等． 微泡超聲空化聲壓幅度與大鼠血腦屏障通透性關系的研究[J]． 中華超聲影像學雜志，2015，15（8）：715-719．

[4] 唐遠姣，向茜，冷錢英，等． 超聲聯合微泡促進大鼠損傷跟腱及肉芽組織局部基因轉染的實驗研究[J]． 四川大學學報（醫學版），2014，45（6）：979-983，1009．

[5] 景香香，劉潔，楊炳昂，等． 超聲微泡介導EGFP轉染正常大鼠關節滑膜組織的研究[J]． 中國超聲醫學雜志，2011，27（3）：203-205．

To Sutdy the Local Injection of Ultrasound Microbubble Promote BMP 2 Expression in Rat Skeletal Muscle

GUO Linqi LIU Liang LI Shuwei LI Yan WANG Dong, Shanxi Medical University, Taiyuan 030002, China

[Abstract]Objective To analysis the local injection of ultrasound microbubbles promoting the role of BMP 2 in expression in rat skeletal muscle. Methods Selected 30 rats were divided into group 1 (blank control), group 2 (direct injection of plasmid), group 3 (injection of plasmid, microbubble target gene), the three groups of rats injected contrast quadriceps agents, saline and BNM 2-EGPF, each group was divided into A, group B, in 7 days, 14 days rats were sacrificed to detect the expression of BMP 2 situation. Results 7 days, group 3 of rats in group A the BMP 2 expression was higher than in group A group 1 and group 2 rats in group A (P＜0.05), 14 days, group 3 of rats in group B the BMP2 expression was higher than in group B group 1 and group 2 rats in group B (P＜0.05). Conclusion Local injection of ultrasound can improve the content of BMP 2 expression in rat skeletal muscle, may provide new ideas for the clinical treatment of fractures disease.

[Key words]Ultrasound microbubbles, BMP 2, Skeletal muscle, Effect

通訊作者：王東，E-mail：30409774@qq．com

doi：10．3969/j．issn．1674-9308．2016．04．018

【文章編號】1674-9308（2016）04-0025-02

【中圖分類號】R-33

【文獻標識碼】A

作者單位：030002太原，山西醫科大學