調味料和保鮮劑協同對淡水魚特征性腐敗菌的抑制作用

劉小莉 賈洋洋 夏秀東 劉源 周劍忠

摘要：以分離自腐敗淡水魚的優勢腐敗菌作為抑菌試驗指示菌，在體外抑菌試驗基礎上篩選抑菌效果優良的保鮮劑和調味料配方，進一步以菌落總數和揮發性鹽基氮含量為指標評估魚塊保鮮效果。結果顯示，以pH值為4的醋酸溶液配制0.05%尼泊金丁酯，對所有受試腐敗菌均有很好的抑菌效果；5%大蒜汁和黃酒也具有一定抑菌作用。以黃酒為基料制備0.05%尼泊金丁酯和5%大蒜汁，并用醋酸將pH值調節為4，浸漬后的白魚魚塊具有明顯保鮮效果，置于25 ℃加速腐敗條件下36 h后，菌落總數和揮發性鹽基氮含量分別為5.40 lg CFU/g、34.97 mg/100 g，未經保鮮處理的對照高達7.99 lg CFU/g、76.61 mg/100 g。

關鍵詞：保鮮劑；調味料；淡水魚；微生物腐敗；揮發性鹽基氮

中圖分類號： TS254.4文獻標志碼：

文章編號：1002-1302（2016）08-0389-03

我國淡水資源豐富，是淡水魚的生產與消費大國，然而淡水魚防腐保鮮體系相對滯后，成為限制淡水魚行業發展的桎梏。冷藏是水產品保鮮的重要手段，但存在于水產品表面的嗜冷微生物依然能夠大量生長，最終導致其腐敗，并表現為自溶、表面發黏、顏色變化、產生異味等現象[1]。

淡水魚的營養成分不同于其他食品，其碳水化合物含量非常少，而蛋白質、游離氨基酸含量非常豐富，同時含有大量三甲胺氧化物（TMAO），這些特性決定了導致水產品腐敗的特征性腐敗微生物[specific spoilage organism（s），SSO]不同于其他食品[2-3]。只有能夠利用蛋白質、氨基酸等營養成分的腐敗細菌才能在此類食品中大量生長，最終導致該類食品腐敗變質。近年來，很多學者對水產品的腐敗微生物生態進行了分析，認為熒光假單胞菌、單核增生李斯特菌、腐敗希瓦菌（Shewanella putrefaciens）、發光細菌（Photobacterium）等是導致水產品腐敗最重要的腐敗細菌，這些腐敗細菌在冷藏階段很快成為優勢微生物，并導致水產品的腐敗[4-5]。

如果不采取適當的防腐保鮮措施，捕撈后的水產品極易腐敗變質，嚴重影響水產品的市場流通和銷售。找到導致水產品腐敗的微生物種類，才能有效進行水產品腐敗的靶向抑制，這是研發水產品加工保藏技術、提高水產品質量的前提。本研究選用食品加工中常用的保鮮劑及調味料，考察保鮮劑和調味料組合對自主分離得到的特征性腐敗菌生長的抑制作用，篩選抑菌效果顯著的保鮮混合液配方，為延長淡水魚產品貨架期、提高產品價值提供依據。

1材料與方法

1.1材料與試劑

購買市售白魚、鯽魚、青魚，于室溫下放置至腐敗，分離其中的優勢腐敗菌作為抑菌試驗指示菌。經生理生化試驗和16S rDNA序列分析鑒定，優勢腐敗菌為漫游球菌Vagococcus sp.BY-1、變形桿菌Proteus sp.BY-2、摩根氏菌Morganella sp.JY-1、泰瑞芽孢桿菌Terribacillus sp.QY-1、賴氨酸芽孢桿菌Lysinibacillus sp.BY-3、糞透明顫菌Vitreoscilla sp.QY-1，分別編號為腐敗菌1～6，于-20 ℃下20%甘油管中保存于筆者所在研究室。

Nisin、山梨酸鉀、雙乙酸鈉、尼泊金乙酯、尼泊金丙酯、尼泊金丁酯、乳酸、醋酸均購自鄭州思源食品添加劑有限公司。白醋、姜醋、香醋、大蒜、生姜、黃酒、白酒等調味料購自超市。

1.2方法

1.2.1培養基配制和菌種活化

肉湯培養基配方為牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、氯化鈉5 g、瓊脂12 g、水1 000 mL，pH值為7.0～7.2，于121 ℃高壓滅菌15 min，保存備用。液體活化采用不添加瓊脂的液體肉湯培養液。

菌株保藏的甘油管于室溫下融化，吸取100 μL保存菌種，接種于5 mL液體肉湯培養基，于30 ℃、120 r/min振蕩培養24 h。

1.2.2抑菌劑配制

保鮮劑的配制參照國家食品添加劑使用標準GB 2760—2014及相關文獻。稱取一定質量商品化防腐劑，以無菌去離子水分別配制成終濃度0.05% Nisin、0.1% 山梨酸鉀、0.2% 雙乙酸鈉、0.05% 尼泊金乙酯、0.05% 尼泊金丙酯、0.05% 尼泊金丁酯，并分別采用乳酸、醋酸將pH值調節至4。分別以不添加防腐劑的乳酸、醋酸溶液作為對照，于4 ℃保存備用。

調味料的制備。選用市售白醋、姜醋、香醋，以無菌去離子水將pH值分別稀釋至3、4、5，于4 ℃保存備用。分別稱取去皮大蒜、生姜，添加4倍體積的無菌去離子水，于高速勻漿機中打成勻漿，過100目篩，得到5%大蒜汁和5%姜汁，于 4 ℃ 保存備用。選用市售黃酒和白酒，保存備用。

1.2.3體外抑菌試驗

采用改良的平板孔阱擴散法[6]研究各種保鮮劑的抗菌活性。采用冷卻的肉湯培養基將活化好的抗菌試驗指示菌種稀釋至106 CFU/mL以上，倒平板。待培養基冷凝后，采用直徑為7 mm的打孔器于平板上均勻打3個孔，吸取10 μL融化的培養基封底，以防止培養基與平皿底間出現裂隙。分別吸取100 μL處理好的保鮮劑注入孔中，于30 ℃下培養48 h后測量抑菌圈大小，計算平均值。

1.2.4魚塊保鮮試驗

選用市售鮮活白魚，經冰水預冷后去除鱗、內臟、頭、尾、皮，瀝干魚體，剔除脊骨，將魚肉分割為約3 cm×3 cm的小塊，混勻后隨機分組。將魚塊浸沒于保鮮劑中，30 min后取出瀝干，置于無菌的包裝袋內密封保存。未經保鮮劑處理的魚塊作為陰性對照。魚塊于25 ℃下保藏，定期取樣，稱取魚塊10 g，添加90 mL去離子水勻漿2 min，以快速定性濾紙過濾，測定濾液的pH值。分別參照國家標準 GB 4789.2—2010、GB/T 5009.44—2003測定魚塊樣品的菌落總數、揮發性鹽基氮TVB-N含量。

2結果與分析

2.1保鮮劑對腐敗菌的抑制效果

目前，商品化的保鮮劑大多在酸性條件下具有最強的抑菌效果[7-8]，本研究分別采用醋酸和乳酸調節保鮮劑溶液的pH值。以乳酸、醋酸調節pH值的保鮮劑溶液對6種淡水魚腐敗菌的抑制效果見表1、表2。結果顯示，pH值為4且不含保鮮劑的乳酸或醋酸對照溶液均沒有抑菌效果；醋酸溶液溶解的保鮮劑的抑菌效果明顯優于乳酸溶液溶解的防腐劑；以乳酸調節pH值的6種保鮮劑中，只有0.05% Nisin、0.2%雙乙酸鈉、0.05%尼泊金丙酯對賴氨酸芽孢桿菌（Lysinibacillus sp.BY-3）（腐敗菌5）具有抑制作用，其他保鮮劑對各種腐敗菌均沒有抑制效果。相同的保鮮劑及濃度，以醋酸調節pH值則抑菌效果顯著增強，0.2%雙乙酸鈉、0.05%尼泊金丁酯對6種受試腐敗菌的生長均具有明顯抑制作用，且尼泊金丁酯的抑菌效果顯著高于其他保鮮劑。在乳酸和醋酸2種不同的pH值環境中，0.05%尼泊金乙酯對所有腐敗菌均沒有抑制作用。表1中，保鮮劑0為pH值為4的乳酸溶液，保鮮劑1～6分別為以pH值為4的乳酸溶液溶解的0.05% Nisin、01%山梨酸鉀、0.2%雙乙酸鈉、0.05%尼泊金乙酯、0.05%尼泊金丙酯、0.05%尼泊金丁酯。表2中，保鮮劑0為pH值為4的醋酸溶液，保鮮劑1～6分別為以pH值為4的醋酸溶液溶解的0.05% Nisin、0.1%山梨酸鉀、0.2%雙乙酸鈉、005%尼泊金乙酯、0.05%尼泊金丙酯、0.05%尼泊金丁酯。

2.2調味料對腐敗菌的抑制作用

多項研究表明傳統調味料具有防腐抑菌作用[9]，本研究選用淡水魚加工中常用的醋、大蒜、生姜、黃酒、白酒等調味料，以適口感為參考依據選擇合適的濃度及用量，考察其抑菌特性。結果表明，各種市售白醋、姜醋、香醋以無菌去離子水稀釋至pH值為4以上時，對6種受試腐敗菌的生長均沒有抑制作用。其他調味料的抑菌活性見表3，其中5%大蒜汁的抑菌活性最顯著，對變形桿菌（Proteus sp.BY-2）、摩根氏菌（Morganella sp.JY-1）、泰瑞芽孢桿菌（Terribacillus sp.QY-1）、糞透明顫菌（Vitreoscilla sp.QY-1）均具有抑制作用；其次為黃酒，對漫游球菌（Vagococcus sp.BY-1）、賴氨酸芽孢桿菌（Lysinibacillus sp.BY-3）、糞透明顫菌（Vitreoscilla sp.QY-1）均具有抑制效果，且對賴氨酸芽孢桿菌（Lysinibacillus sp.BY-3）抑制作用最強，抑菌圈直徑達（19.02±1.76） mm；5%姜汁對受試的6種腐敗菌均無抑制作用；白酒僅對賴氨酸芽孢桿菌（Lysinibacillus sp.BY-3）具有一定抑制作用。

2.3魚塊的防腐

根據以上結果將防腐浸制液的配方確定為：稱取適量大蒜，加入4倍體積的黃酒，打漿后過濾，向濾汁中添加尼泊金丁酯使其終濃度為0.05%，使用醋酸將混合液的pH值調節至4。魚塊在此混合保鮮液中浸漬后保藏，對照和保鮮劑處理的魚塊在儲藏期內的菌落總數、揮發性鹽基氮含量變化趨勢見圖1、圖2。與未經處理的對照相比，保鮮劑浸漬處理的魚塊在儲藏期內菌落總數、揮發性鹽基氮含量的增長速度顯著緩慢。36 h后對照魚塊的菌落總數達7.99 lg CFU/g （98×107 CFU/g），保鮮處理的魚塊則為5.40 lg CFU/g，且 24 h 后增長速率減緩。對照和經保鮮處理魚塊的揮發性鹽基氮含量增加趨勢類似，36 h后對照組樣品的揮發性鹽基氮含量高達76.61 mg/100 g，具有明顯的腐臭味；經保鮮處理的樣品中揮發性鹽基氮含量僅為34.97 mg/100 g，約為對照組含量的一半。可見，保鮮防腐處理對魚塊腐敗菌的生長具有明顯抑制作用。

3結論與討論

水產品貯藏保鮮技術的開發是養殖、捕撈生產活動的延續，是加工企業創收的必要保證。與傳統水產品保鮮技術和現代高新保鮮技術相比，食品保鮮劑的應用更加簡便和經濟，高效地達到水產品保鮮的要求，突破傳統繁瑣的保鮮措施和昂貴的現代設備投資瓶頸，是水產品及其他食品貯藏保鮮的重要發展方向。

本研究結果顯示，不同保鮮劑或不同溶液體系中的相同保鮮劑對淡水魚特征性腐敗菌的抑制作用具有很大差異。食品保鮮劑品種多樣。Nisin是一種高效、無毒、安全、營養的天然食品保鮮劑，對革蘭氏陽性菌具有廣譜抑制作用，對可形成芽孢的細菌具有更強的抗菌效果[7]。祝銀等對凍藏金槍魚肌肉的硬度、彈性、凝聚性等進行測試發現，Nisin保鮮液可適當延長凍藏金槍魚的保鮮期，其最適質量濃度為0.4 g/L[10]。然而本研究結果顯示，Nisin僅對賴氨酸芽孢桿菌具有抑制作用，對其他受試的腐敗菌均無抑制作用。

苯甲酸、山梨酸及其鹽類等化學防腐劑是國內常用的食品防腐劑，其成本低于天然防腐劑，但其防腐效果受微生物種類、食品成分、pH值、溶解性等因素影響，具有一定使用局限性，一般僅能在酸性條件下使用。尼泊金酯是一類廣譜、高效、低毒的防腐劑，且不易受食品pH值的影響，在pH值為 4～8 的范圍內均具有很好的抑菌能力[11]。本研究結果表明，尼泊金丁酯對所有受試腐敗菌的生長均具有抑制作用，其抑菌譜最廣且抑菌活性高。鄒玉萍等研究各種單酯在蒸煮袋熟魚的保藏效果時發現，丁酯的防腐能力高于丙酯和乙酯[12]。

單一的防腐劑通常存在一定缺陷，須采用復合防腐技術才能發揮互補和相乘效果，有效阻止微生物的生長和其他不利因素，達到優勢互補、相得益彰的目的。保鮮劑與傳統水產加工調味料的復合使用對腐敗菌具有很好的抑制作用，與微生物酶系統中的巰基結合，從而破壞很多酶系統，達到抑制微生物生長、繁殖及防腐的效果，進而有效抑制TVBN的增長，延緩魚肉的腐敗變質[13]。

[HS25][HT8.5H]參考文獻：

[1]李湘利，劉靜. 水產品貯藏保鮮技術及發展趨勢[J]. 中國水產，2006（5）：62-63.

[2]Dalgaard P. Qualitative and quantitative characterization of spoilage bacteria from packed fish[J]. International Journal of Food Microbiology，1995，26（3）：319-333.

[3]羅慶華. 水產品特點腐敗菌研究進展[J]. 食品科學，2010，31（23）：468-472.

[4]Parlapani F F，Verdos G I，Haroutounian S A，et al. The dynamics of Pseudomonas and volatilome during the spoilage of gutted sea bream stored at 2 degrees C[J]. Food Control，2015，55：257-265.

[5]Tong T A N，Noseda B，Samapundo S，et al. Microbial ecology of Vietnamese Tra fish （Pangasius hypophthalmus） fillets during processing[J]. International Journal of Food Microbiology，2013，167（2）：144-152.

[6]Gomez S，Cosson C，Deschamps A M. Evidence for a bacteriocin-like substance produced by a new strain of Streptococcus sp.，inhibitory to Gram-positive food-borne pathogens[J]. Research in Microbiology，1997，148：757-766.

[7]李有起. Nisin在食品防腐作用中的研究進展[J]. 食品研究與開發，2012，33（4）：233-235.

[8]鐘國清. 雙乙酸鈉的應用研究進展[J]. 飼料工業，2006，27（3）：39-43.

[9]姜井軍，方芳. 8種調味料提取液抑菌效果研究[J]. 山東化工，2014，43（12）：107-110，113.[ZK）]

[10]祝銀，劉琴，嚴忠雍，等. Nisin生物保鮮劑對凍藏金槍魚的影響[J]. 廣州化工，2013，41（24）：41-43.

[11]張顯久，蘇德俏，沈健，等. 尼泊金復合酯作為防腐劑在食品中的應用[C]. 第十一屆中國國際食品添加劑和配料展覽會學術論文集，上海，2007：362-364.

[12]鄒玉萍，夏文水. 尼泊金酯對蒸煮袋熟魚防腐保藏[J]. 食品與生物技術學報，2009，28（2）：167-171.

[13]鄧思瑤，楊文鴿，周星宇，等. 包裝方式和山梨酸鉀處理對冷藏鮐魚品質的影響[J]. 核農學報，2015，29（3）：506-512.