白藜蘆醇阻斷轉化生長因子-/Smad通路抑制人結腸癌細胞系SW480侵襲轉移實驗研究

宋康杰

白藜蘆醇阻斷轉化生長因子-/Smad通路抑制人結腸癌細胞系SW480侵襲轉移實驗研究

宋康杰

目的探討中藥白藜蘆醇對SW480細胞活力及侵襲轉移力的影響。方法將人結腸癌細胞系SW480用白藜蘆醇處理48h，MTT法檢測白藜蘆醇對SW480細胞活力的影響；流式細胞術檢測白藜蘆醇對SW480細胞周期的影響；Transwell穿膜試驗檢測白藜蘆醇對SW480細胞侵襲轉移能力的影響；western blot實驗檢測腫瘤細胞轉移相關蛋白E-上皮型細胞鈣黏蛋白（E-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）及基質金屬蛋白酶-9（MMP-9）的表達水平；Western blot實驗檢測上游磷酸化Smad蛋白（p-Smad）的表達水平。結果對照組及5、10、15、20、40μmol/L白藜蘆醇組對SW480細胞活力的抑制率分別為0、（5.4±1.0）%、（22.5±3.3）%、（36.4±4.4）%、（62.2±6.1）%、（85.1±7.5）%，各組間細胞活力抑制率差異有統計學意義（P＜0.05）。對照組及5、10、15、20、40μmol/L白藜蘆醇組對SW480細胞周期G2/M阻滯率分別為（2.3±0.3）%、（4.3±0.5）%、（8.9±1.2）%、（15.6±2.3）%、（22.7± 2.7）%、（30.4±2.9）%，各組間G2/M阻滯率差異有統計學意義（P＜0.05）。對照組及轉化生長因子-β （TGF-β）組、TGF-β+5μmol/L白藜蘆醇組、TGF-β+10μmol/L白藜蘆醇組、TGF-β+15μmol/L白藜蘆醇組、TGF-β+20μmol/L白藜蘆醇組、TGF-β+40μmol/L白藜蘆醇組穿過Transwell膜的SW480細胞數分別為（204.2±19.4）個、（453.5±41.6）個、（411.2±45.2）個、（315.7±32.7）個、（246.3±27.2）個、（197.8±23.5）個、（97.4±11.2）個，各組間細胞數差異有統計學意義（P＜0.05）。白藜蘆醇體外處理置于TGF-β培養體系中的SW480細胞后，E-cadherin表達水平顯著上升，Vimentin及MMP-9表達水平顯著下降（P＜0.05）。白藜蘆醇顯著降低TGF-β誘導的SW480細胞Smad蛋白磷酸化水平。結論白藜蘆醇有良好的體外抗結腸癌的生物活性，更重要的是它能通過阻斷TGF-β/Smad通路抑制結腸癌細胞的侵襲轉移。

結腸癌細胞；SW480；白藜蘆醇；轉移；TGF-β；Smad

目前認為[1-2]，腫瘤微環境中的很多細胞因子，如轉化生長因子-β（TGF-β）、肝生長因子（HGF）和表皮生長因子（EGF）等能誘導腫瘤細胞發生侵襲轉移。其中，TGF-β與腫瘤的轉移關系尤為密切。本研究探討中藥白藜蘆醇是否對結腸癌的生長和轉移有抑制作用，同時研究其具體機制。

1 材料與方法

1.1 細胞及培養 人結腸癌細胞系SW480來源于美國模式菌種收集中心（ATCC），細胞培養在含10%胎牛血清的DMEM培養基中，培養環境為37℃恒溫且通入5%的CO2。

1.2 實驗試劑 DMEM培養基及胎牛血清購于美國Gibco公司。白藜蘆醇、噻唑藍（MTT）、TGF-β、碘化丙啶（PI）購于美國Sigma公司。LY2109761購于美國AdooQ公司。E-上皮型細胞鈣黏蛋白（E-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）、基質金屬蛋白酶-9（MMP-9）、磷酸化Smad蛋白（p-Smad）及β-肌動蛋白（βactin）抗體購于美國cell signaling公司。Transwell小室購于美國康寧公司。ECL試劑盒購于美國Pierce公司。

1.3 MTT試驗 將SW480細胞按5×103個/孔接種于96孔板，加入200μL含10%胎牛血清的DMEM培養，設置3個復孔。在培養體系中分別加入5、10、15、20、40μmol/L的白藜蘆醇培養48h，對照組為不加白藜蘆醇同樣條件培養48h。加入20μL 5mg/mL MTT繼續培養4h。棄上清，往孔中加入150μL二甲亞砜，充分震蕩后在570nm波長下用酶標儀檢測OD值。按以下公式計算SW480的細胞活力抑制率：抑制率=（對照組OD值-白藜蘆醇組OD值）/對照組OD值×100%。

1.4 細胞周期檢測 將SW480細胞按5×105個/孔接種于6孔板，加入2mL含10%胎牛血清的DMEM培養。在培養體系中分別加入5、10、15、20、40μmol/L的白藜蘆醇培養48h，對照組為不加白藜蘆醇同樣條件培養48h。收集細胞用生理鹽水洗2次，用70%乙醇在4℃固定過夜后用生理鹽水清洗，加入（50μg/mL）RNA酶，100μg/mL PI在暗處染色30min后用流式細胞儀檢測細胞周期，G2期細胞所占比率可表示為腫瘤細胞進入G2/M阻滯[3]。

1.5 Transwell穿膜實驗檢測SW480細胞轉移能力

在Transwell小室中接種1×104個SW480細胞置于24孔板中，上室培養基為無血清DMEM培養基并加入5ng/mL TGF-β模擬腫瘤微環境。在上室中分別加入5、10、15、20、40μmol/L的白藜蘆醇。下室培養基為含10%胎牛血清的DMEM培養基。48h后取出Transwell小室，用生理鹽水洗去小室內未附著于Transwell膜的細胞，將Transwell膜用3%多聚甲醛固定20min后用0.1%結晶紫染色20min，低倍鏡（100×）觀察4個隨機選擇的區域，計算細胞總數。膜上細胞數目越多，說明SW480細胞的轉移能力越強。

1.6 Western blot試驗 將SW480細胞按5×105個/孔接種于6孔板，加入2mL含10%胎牛血清及5ng/mL 的DMEM培養。在培養體系中分別加入5、10、15、20、40μmol/L的白藜蘆醇培養48h，對照組為不加白藜蘆醇同樣條件培養48h。培養完成后將細胞裂解，取等量蛋白提取液在12.5%的丙烯酰胺中進行SDSPAGE，之后將凝膠取下將蛋白轉膜到PVDF膜上。將膜分別在E-cadherin、Vimentin、MMP-9、p-Smad 及β-actin抗體中孵育過夜，之后在帶辣根過氧化物酶活性的二抗稀釋液中孵育2h，ECL試劑顯色曝光，于暗室中曝光X膠片，以目的蛋白與β-actin蛋白顯色后的灰度比值表示目的蛋白的相對表達水平。

2結果

2.1 白藜蘆醇對結腸癌細胞系SW480細胞活力和細胞周期的影響 MTT結果和細胞周期檢測結果表明白藜蘆醇在體外能顯著抑制SW480的細胞活力，同時，使SW480細胞進入G2/M阻滯，阻斷腫瘤細胞的細胞周期，見表1。

表1 白藜蘆醇對SW480細胞活力和細胞周期的影響（±s）

表1 白藜蘆醇對SW480細胞活力和細胞周期的影響（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與5μmol/L白藜蘆醇組比較，＃P＜0.05；與10μmol/L白藜蘆醇組比較，□P＜0.05；與15μmol/L白藜蘆醇組比較，△P＜0.05；與20μmol/L白藜蘆醇組比較，&P＜0.05.

?

2.2 白藜蘆醇對結腸癌細胞系SW480侵襲轉移能力的影響 Transwell穿膜實驗結果表明白藜蘆醇能顯著降低TGF-β誘導的SW480細胞轉移能力，并使腫瘤細胞多種轉移相關基因表達譜發生改變，見表2。

2.3 白藜蘆醇通過阻斷 TGF-β/Smad通路抑制SW480細胞的轉移 Western blot結果表明白藜蘆醇（20μmol/L）可顯著抑制TGF-β誘導的Smad蛋白的磷酸化，進而抑制SW480細胞的轉移并改變轉移相關蛋白譜的表達水平，TGF-β/Smad通路特異性抑制劑LY2109761[4]（5μmol/L）對SW480細胞的生物效應與白藜蘆醇（20μmol/L）相似，證明了TGF-β/Smad通路是白藜蘆醇的靶位點，見表3。

表2 白藜蘆醇對TGF-β誘導的SW480細胞轉移能力的影響（±s）

表2 白藜蘆醇對TGF-β誘導的SW480細胞轉移能力的影響（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與TGF-β組比較，§P＜0.05；與TGF-β+5μmol/L白藜蘆醇組比較，＃P＜0.05；與TGF-β+10μmol/L白藜蘆醇組比較，△P＜0.05；與TGF-β+15μmol/L白藜蘆醇組比較，□P＜0.05；與TGF-β+20μmol/L白藜蘆醇組比較，○P＜0.05；TGF-β：轉化生長因子-β；E-cadherin：E-上皮型細胞鈣黏蛋白；β-actin：β-肌動蛋白；Vimentin：波形蛋白；MMP-9：基質金屬蛋白酶-9

表3 白藜蘆醇對SW480細胞TGF-β/Smad通路的影響（±s）

表3 白藜蘆醇對SW480細胞TGF-β/Smad通路的影響（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與5ng/mL TGF-β組比較，▲P＜0.05；p-Smad：磷酸化Smad蛋白；TGF-β：轉化生長因子-β；E-cadherin：E-上皮型細胞鈣黏蛋白；β-actin：β-肌動蛋白；Vimentin：波形蛋白；MMP-9：基質金屬蛋白酶-9

?

3 討論

研究[5-7]表明白藜蘆醇有十分良好的抗腫瘤效應，如白藜蘆醇可上調促凋亡蛋白的表達誘導纖維肉瘤細胞發生凋亡；白藜蘆醇通過激活P38和JNK介導的H2AX磷酸化誘導白血病細胞發生凋亡；白藜蘆醇還可通過ROS途徑誘導卵巢癌細胞的死亡等。本研究發現白藜蘆醇具有顯著的體外抗結腸癌作用，能顯著抑制結腸癌細胞的細胞活力，并將結腸癌細胞的細胞周期阻滯在G2/M期，抑制腫瘤細胞的增殖。

研究顯示，通過Transwell穿膜實驗證明白藜蘆醇可有效抑制TGF-β介導的結腸癌細胞的轉移，改變結腸癌細胞的腫瘤轉移相關蛋白表達譜。E-cadherin作為一種鈣依賴性地跨膜糖蛋白，是調節細胞與細胞之間黏附反應的重要媒介，是維護上皮細胞形態和結構完成的重要分子。研究[8]表明，E-cadherin表達的缺失可促使腫瘤細胞之間黏附力下降，進而使腫瘤細胞變地松散并傾向于向周圍組織浸潤，增加腫瘤的惡性程度。Vimentin和MMP-9是腫瘤細胞向周圍基質細胞侵襲擴散的必須蛋白，研究[9-10]表明，Vimentin和MMP-9基因的表達水平越高，腫瘤的惡性程度越高。本研究發現白藜蘆醇可顯著上調結腸癌細胞E-cadherin的表達，下調Vimentin和MMP-9的表達，進而抑制結腸癌的侵襲轉移。

TGF-β/Smad信號通路與腫瘤細胞的增殖、分化和轉移密切相關。在這一系統中，TGF-β通過與TGF-βRI受體結合激活下游分子Smad發生磷酸化，激活Smad復合物。該復合物能進入細胞核調節多種基因的轉錄，如下調E-cadherin的表達水平，上調Vimentin和MMP-9的表達水平，從而促進腫瘤組織的上皮細胞間質轉型（EMT），使腫瘤細胞發生轉移[11-12]。本研究結果證明，白藜蘆醇可顯著抑制TGF-β介導Smad磷酸化，這可能是白藜蘆醇抑制結腸癌細胞轉移的重要機制。

綜上所述，本研究提示白藜蘆醇有潛在的抗結腸癌的生物效應，可顯著降低結腸癌的轉移傾向，其機制可能為白藜蘆醇可顯著抑制TGF-β介導Smad磷酸化，為結腸癌的藥物治療提供了新的途徑和理論依據。

［1］Harrison SM，Knifley T，O'Connor KL，et al.LPA，HGF，and EGF utilize distinct combinations of signaling pathways to promote migration and invasion of MDA-MB-231 breast carcinoma cells［J］.BMC Cancer，2013，13：501.

［2］Tian M，Neil JR，Schiemann WP.Transforming growth factorbeta and the hallmarks of cancer［J］.Cell Signal，2011，23 （6）：951-962.

［3］王錦軍.蛇床子素抑制人肝癌細胞生長和TGF-β誘導的侵襲轉移［J］.浙江中西醫結合雜志，2015，25（3）：246-252.

［4］Ren XF，Mu LP，Ma JF，et al.LY2109761 inhibits metastasis and enhances chemosensitivity in osteosarcoma MG-63 cells［J］.Eur Rev Med Pharmacol Sci，2015，19（7）：1182-1190.

［5］Harati K，Slodnik P，Daigeler A，et al.Resveratrol induces apoptosis and alters gene expression in human fibrosarcoma cells［J］.Anticancer Res，2015，35（2）：767-774.

［6］Wu XP，Xiong M，Lu CR，et al.Resveratrol induces apoptosis of human chronic myelogenous leukemia cells in vitro through p38 and JNK-regulated H2AX phosphorylation［J］. Acta Pharmacol Sin，2015，36（3）：353-361.

［7］Seino M，Okada M，Kitanaka C，et al.Differential contribution of ROS to resveratrol-induced cell death and loss of selfrenewal capacity of ovarian cancer stem cells［J］.Anticancer Res，2015，35（1）：85-96..

［8］Zhang Z，Yang C，Tan Y，et al.FOXA2 attenuates the epithelial to mesenchymal transition by regulating the transcription of E-cadherin and ZEB2 in human breast cancer［J］. Cancer Lett，2015，361（2）：240-250.

［9］P Lampropoulos，A Zizi-Sermpetzoglou，AG Papavassiliou，et al.TGF-beta signalling in colon carcinogenesis［J］.Cancer Lett，2012，314（1）：1-7.

［10］F Sipos，O Galamb.Epithelial-to-mesenchymal and mesenchymal-toepithelial transitions in the colon［J］.World J Gastroenterol，2012，18（7）：601-608.

［11］Geng J，Fan J，Yu J，et al.Loss of PPM1A expression enhances invasion and the epithelial-to-mesenchymal transition in bladder cancer by activating the TGF-β/Smad signaling pathway［J］.Oncotarget，2014，5（14）：5700-5711.

［12］Jung HY，Fattet L，Yang J.Molecular pathways:linking tumor microenvironment to epithelial-mesenchymal transition in metastasis［J］.Clin Cancer Res，2014，21（5）：962-968.

（收稿：2015-05-06 修回：2015-08-07）

Resveratrol Inhibited the Metastasis of Colon Cancer SW480 Cells Via Suppressing the TGF-/Smad Path－way

SONG Kangjie. Department of Pharmacy,Ningbo Beilun Maternal＆Child Care Hospital,Ningbo(315800),China

ObjectiveTo investigate the effect of resveratrol on the cell viability and metastasis in SW480 cells in vitro.MethodsSW480 cells were treated with resveratrol for 48h:the cell viability was measured by MTT assay,the cell cycle was evaluated by flow cytometry analysis,and the metastasis was evaluated by Transwell assay. Metastasis associated proteinsE-cadherin,vimentin and MMP-9 in SW480 cells treated with resveratrol were detected by using Western Blot analysis.The upstream pathway proteinphosphorylated Smad（p-Smad）was detected in SW480 cells treated with resveratrol by Western Blot analysis.Results Cell viability inhibitory rate of SW480 cells in control group,5μmol/L resveratrol group,10μmol/L resveratrol group,15μmol/L resveratrol group,20μmol/L resveratrol group,and 40μmol/L resveratrol group were 0,（5.4±1.0）%,（22.5±3.3）%,（36.4±4.4）%,（62.2±6.1）%, and（85.1±7.5）%,respectively,with a significant difference among them（P＜0.05）.The cell cycle G2/M inhibitory rate of SW480 cells in above groups were as follows:（2.3±0.3）%，（4.3±0.5）%，（8.9±1.2）%，（15.6±2.3）%，（22.7± 2.7）%，and（30.4±2.9）%,with a significant differenceamong groups（P＜0.05）.The number of cells thatpenetrated the Transwell membrane in control group,TGF-β group,TGF-β+5μmol/L resveratrol group,TGF-β+10μmol/L resvera－trol group,TGF-β+15μmol/L resveratrol group,TGF-β+20μmol/L resveratrol group,and TGF-β+40μmol/L resveratrol group were as follows:204.2±19.4,453.5±41.6,411.2±45.2,315.7±32.7,246.3±27.2,197.8±23.5,97.4±11.2, with a significant differenceamong groups（P＜0.05）.Western blot analysis showed the expression of E-cadherin was significantly up-regulated,while the Vimentin and MMP-9 were down-regulated by resveratrol treatment in SW480 cells（all P＜0.05）.The expression ofp-Smad was significantly down-regulated when SW480 cells were treated with resveratrol.ConclusionResveratrol showed a significant anti-tumor effect in human colon cancerin vitro.More importantly,resveratrol could inhibit the metastasis of SW480 cells via suppressing the TGF-/Smad pathway.

colon cancer cells;SW480;resveratrol;metastasis;TGF-β;Smad

浙江省寧波市北侖區婦幼保健院藥劑科（寧波 315800）