KT對刺葡萄愈傷組織花青素含量的影響

賴呈純，黃賢貴，黃金澤，潘 紅，范麗華*，謝鴻根，王 琦

(1.福建省農業科學院農業工程技術研究所 350003；2.福建省農業科學院農業經濟與科技信息研究所)

KT對刺葡萄愈傷組織花青素含量的影響

賴呈純1，黃賢貴1，黃金澤2，潘 紅1，范麗華1*，謝鴻根1，王 琦1

(1.福建省農業科學院農業工程技術研究所 350003；2.福建省農業科學院農業經濟與科技信息研究所)

以長期保持的紫紅色刺葡萄愈傷組織DLR細胞系為試驗材料，研究不同KT濃度對其花青素和原花青素含量的影響，結果表明：KT可以有效調控刺葡萄愈傷組織花青素和原花青素的合成，其中以MS+2,4-D 1.0 mg/L+KT 0.05 mg/L培養基效果最佳，花青素和原花青素含量分別達到66.95 μg/g(FW)和3947.50 μg/g(FW)，分別是對照的2.44倍和1.68倍。

刺葡萄；6-糠氨基嘌呤(KT)；花青素；原花青素；愈傷組織

LAI Cheng-chun1, HUANG Xian-gui1, HUANG Jin-ze2, PAN Hong1, FAN Li-Hua1*, XIE Hong-Gen1, WANG Qi1

(1.InstituteofAgriculturalEngineeringandTechnology,FujianAcademyofAgriculturalSciences,FujianProvince350003；2.AgriculturalEconomyandScienceandTechnologyInformationResearchInstituteFujianAcademyofAgriculturalSciences,FujianProvince)

花青素和原花青素是清除人體自由基最有效的天然抗氧化劑，具有抗氧化、抗突變、抗腫瘤、保護心血管等方面的功能[1-3]。目前，天然的原花青素主要來源于松樹皮和葡萄籽，隨著市場需求的不斷擴大，原有來源于葡萄、松樹皮或其他替代植物的生物活性物質已不能滿足市場需求，必須尋求更多更可靠的材料來源。植物細胞培養是生物技術領域的一個重要分支，是解決藥用植物資源匱乏的有效途徑[4]。然而，要通過細胞培養開展刺葡萄花青素生產，必須建立高含量花青素刺葡萄愈傷組織培養技術體系。本研究課題組曾對誘導產生并長期保持的兩個同質不同型刺葡萄細胞系進行系列研究[5]，研究中發現，6-糠氨基嘌呤(KT)可顯著提高刺葡萄愈傷組織花青素含量。為了進一步了解KT對刺葡萄愈傷組織花青素含量的影響，在前期研究的基礎上，通過對培養基中KT濃度優化，以期大幅度提高刺葡萄愈傷組織細胞中花青素的含量，從而為葡萄花青素的規?；a提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

以福建省農業科學院農業工程技術研究所葡萄研究室誘導并長期保持的紫紅色刺葡萄愈傷組織DLR細胞系[5]為試驗材料。

1.2 方法

1.2.1 培養基配方處理 根據前期的研究，以刺葡萄愈傷組織同步化培養基M0為對照處理(MS+2,4-D 1.0 mg/L)，設計添加6種濃度KT的培養基配方，用于其對刺葡萄愈傷組織花青素含量影響的研究，具體配方如下，M1：MS+2,4-D 1.0 mg/L+KT 0.05 mg/L，M2：MS+2,4-D 1.0 mg/L+KT 0.10 mg/L，M3：MS+2,4-D 1.0 mg/L+KT 0.50 mg/L，M4：MS+2,4-D 1.0 mg/L+KT 1.00 mg/L，M5：MS+2,4-D 1.0 mg/L+KT 1.50 mg/L，M6：MS+2,4-D 1.0 mg/L+KT 2.00 mg/L。以上培養基均加入蔗糖30 g/L、瓊脂粉6 g/L，pH值調整為5.8左右。

1.2.2 刺葡萄愈傷組織的選擇與預培養 為了使細胞旺盛生長并趨于同步化，需對細胞進行預培養，具體做法：選取長期繼代培養過程中穩定顯示紫紅色的刺葡萄愈傷組織細胞系DLR，繼代培養20 d 后，挑取愈傷組織細胞團表層略帶部分里層的細胞作為接種材料，接種到未添加KT的M0培養基中培養20 d，作為下一步試驗的接種材料。

1.2.3 刺葡萄愈傷組織接種與培養 選取預培養后的刺葡萄愈傷組織，接種到附加不同濃度KT的6種配方處理培養基中培養，并以在M0培養基中培養的刺葡萄愈傷組織為對照。每種培養基接種20瓶，設3次重復，培養25 d和35 d時分別收集愈傷組織，用液氮速凍后，于-80℃下保存，備用。

1.2.4 刺葡萄愈傷組織花青素與原花青素含量測定 刺葡萄愈傷組織花青素與原花青素含量測定參照賴呈純等[5]的方法。

1.2.5 數據統計分析 試驗數據采用DPS數據分析軟件進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 不同培養天數和不同培養基對刺葡萄細胞花青素含量的影響

在預培養后的細胞中挑取合適大小的細胞團(表層略帶部分里層的細胞)作為接種的材料，接種到6種配方處理的培養基中培養。培養25 d和35 d 時分別取樣，測定細胞培養物中花青素含量，結果見表1。從培養天數變化來看，從培養25 d到35 d，花青素含量極顯著升高。從不同培養基來看，培養25 d時，在KT濃度為0～2.0 mg/L范圍內，隨KT濃度的增加，刺葡萄細胞中花青素含量呈先增加后降低再增加的趨勢，增加和降低的幅度較小，最高為M6培養基，達18.52 μg/g(FW)；其次是M2培養基，為18.18 μg/g(FW)；第三是M1培養基，為15.44 μg/g(FW)；含量最低是對照處理M0培養基，為8.92 μg/g(FW)；除M4培養基外，其他培養基配方處理的刺葡萄細胞中花青素含量均極顯著高于對照處理的M0培養基。培養35 d時，在KT濃度為0～2.0 mg/L范圍內，隨KT濃度的增加，花青素含量也呈先急劇增加后迅速降低再增加的趨勢，花青素含量最高的是M1培養基，達66.95 μg/g(FW)，并極顯著高于其他培養基配方處理；其次是M6培養基，為50.60 μg/g(FW)；第三是M2培養基，為39.54 μg/g(FW)；最低的是M3培養基，為22.22 μg/g(FW)。從以上分析結果可以看出，當刺葡萄細胞在M1培養基中培養35 d時，最有利于其花青素合成，花青素含量高達66.95 μg/g(FW)，是對照處理M0培養基中刺葡萄細胞花青素含量的2.44倍。因此，刺葡萄細胞在MS+2,4-D 1.0 mg/L+KT 0.05 mg/L培養基中培養，可極大地提高其花青素含量。

表1 不同培養基中刺葡萄細胞花青素含量

注：①表中同列數據后無相同小寫字母的表示差異顯著(P<0.05)，無相同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)；②按鮮重測定，下同。

2.2 不同培養天數和不同培養基對刺葡萄細胞原花青素含量的影響

本研究進一步考察不同培養基對刺葡萄細胞中原花青素含量的影響。分別取25 d和35 d的刺葡萄細胞培養物，測定細胞培養物中原花青素含量，結果見表2。從培養天數變化來看，從培養25 d到35 d原花青素含量極顯著升高。從不同培養基來看，KT濃度在0～2.0 mg/L范圍內，培養25 d時，原花青素含量隨KT濃度的升高呈現先增加后降低的趨勢，但增加和降低的幅度很小，在各培養基中培養的刺葡萄細胞原花青素含量除M1和M2與對照處理的M0培養基差異顯著外，其余差異都不顯著，原花青素含量最高的是M2培養基，為1433.65 μg/g(FW)；其次是M1培養基，為1406.48 μg/g(FW)；含量最低的是M0培養基，為1100.33 μg/g(FW)。培養35 d時，KT濃度在0～2.0 mg/L范圍內，隨KT濃度的增加，刺葡萄細胞中原花青素含量呈先急劇升高后迅速下降再緩慢升高的趨勢，原花青素含量最高時對應的培養基是M1，為3947.50 μg/g(FW)；其次是M6培養基，為2789.65 μg/g(FW)；含量最低的是M4培養基，為1836.24 μg/g(FW)。從以上分析可以看出，在M1培養基中培養35 d的刺葡萄細胞，其原花青素含量極顯著高于其他配方的培養基處理，高達3947.50 μg/g(FW)，是對照處理M0培養基的1.68倍。因此，刺葡萄細胞在MS+2,4-D 1.0 mg/L+KT 0.05 mg/L培養基中培養，可極大地提高其原花青素含量。

表2 不同培養基中刺葡萄細胞原花青素含量變化情況

3 小結與討論

植物細胞培養具有不受季節影響、生長周期短、產物均一可控、活性物質含量高等優點，被認為是解決藥用植物資源匱乏的有效途徑。目前，植物細胞培養生產天然活性物質已經取得很大進展[6]。因此，建立刺葡萄細胞培養生產花青素的技術體系，有望為花青素生產提供豐富的原材料。然而，如何有效提高刺葡萄細胞中花青素的含量，仍是目前亟須解決的問題。有研究表明，適量的細胞分裂素KT可以促進植物細胞分裂和增殖，并增加細胞中次生產物的含量，Narayan等[7]的研究證明，在添加0.2 mg/L KT的培養基中培養，可較顯著地增加玫瑰茄細胞花青素含量。本研究發現，添加KT可以有效地調控刺葡萄細胞中花青素的合成，培養基中添加不同濃度KT均可增加刺葡萄愈傷組織花青素和原花青素含量，以MS+2,4-D 1.0 mg/L+KT 0.05 mg/L培養基效果最佳，其花青素和原花青素含量分別是對照的2.44倍和1.68倍。該研究結果可為進一步進行刺葡萄細胞規模化培養生產花青素提供技術支撐。

[1]Thorne Research Inc.Oligomeric Proanthocyanidins (OPCs) (Monograph)[J].Altern Med Rev,2003,8(4):442-450.

[2]ZI S X,MA H J,LI Y,et al.Oligomeric proanthocyanidins from grape seeds effectively inhibit ultraviolet-induced melanogenesis of human melanocytes in vitro[J].Intern J Mol Med,2009,23:197-204.

[3]PRAPHASAWAT R,KLUNGSUPYA P,MUANGMAN T,et al.Antimutagenicity and antioxidative DNA damage properties of oligomeric proanthocyanidins from thai grape seeds in TK6 cells[J].Asian Pac J Cancer P,2011,12:1317-1321.

[4]DONNEZ D,JEANDET P,CLéMENT C,et al.Bioproduction of resveratrol and stilbene derivatives by plant cells and microorganisms[J].Trends Biotechnol,2009,27(12):706-713.

[5]賴呈純,范麗華,黃賢貴,等.刺葡萄幼胚愈傷組織誘導及其高產原花青素細胞系篩選[J].植物生理學報,2014,50(11):1683-1691.

[6]呂春茂，范海延，姜河，等.植物細胞培養技術合成次生代謝物質研究進展[J].云南農業大學學報,2007,21(1):1-5.

[7]NARAYAN M S,THIMMARAJU R, BHAGYALAKSHMI N.Interplay of growth regulators during solid-state and liquid-state batch cultivation of anthocyanin producing cell line ofDaucuscarota[J].Process Biochemistry,2005,40(1):351-358.

(責任編輯：楊小萍)

Effect of KT on anthocyanin content in callus of brier grape (VitisdavidiiFoёx)

Using the long-term maintained and purplish red callus of brier grape as test material, the effect of different KT concentration on its anthocyanin and proanthocyanidinscontent was investigated in this paper. The result showed that the anthocyanin and proanthocyanidins synthesis of brier grape callus could be regulated effectively by KT. The optimal medium was MS+2,4-D 1.0 mg/L+KT 0.05 mg/L, the anthocyanincontent and proanthocyanidinscontent were up to 66.95 μg/g(FW) and 3947.50 μg/g(FW), and they were 2.44 times and 1.68 times as control respectively.

Brier grape; 6-aminofurfurylpurine(KT); anthocyanin; proanthocyanidins; callus

2016-07-30

賴呈純，男，1975年生，博士，副研究員。

*通訊作者：范麗華，女， 1957年生，副研究員 (E-mail：512264119@qq.com)。

福建省科技計劃項目 ——省屬公益類科研院所基本科研專項(2014R1015-6)；福建省自然科學基金項目(2016J01126)；福建省種業創新與產業化工程項目(FJZZZY-1520)；“十二五”農村領域國家科技計劃項目(2013BAD01B05-7)。

10.13651/j.cnki.fjnykj.2016.09.001