抑制miR181b通過上調PKG-1減輕大鼠心肌細胞肥大

楊軍曹謙鐘偉李倩金濤

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抑制miR181b通過上調PKG-1減輕大鼠心肌細胞肥大

楊軍①曹謙②鐘偉①李倩①金濤①

【摘要】目的：通過檢測miR181b在心肌肥厚患者外周血中的表達，研究miR181b與PRKG-1在心肌肥大中的作用機制，為心肌肥厚臨床診斷和治療提供新的靶點。方法：采用實時定量PCR方法檢測50例臨床診斷為心肌肥厚患者及25例正常健康人的外周血miR181b的水平，分析其表達水平與臨床病理特征的關系。結果：miR181b在心肌肥厚患者外周血中表達（3.35±0.22）升高，差異有統計學意義（P<0.05）；體外大鼠原代心肌細胞在鏡下呈多角形，采用α-橫紋肌肌動蛋白抗體和DAPI進行免疫熒光染色，鏡下90%以上細胞發出綠色熒光，表明原代培養心肌細胞純度較高；采用去氧腎上腺素處理心肌細胞72 h后，心肌細胞總蛋白表達顯著升高（P<0.05）；流式細胞術結果顯示PE組心肌細胞大小明顯增加（P<0.05）；實時定量PCR檢測結果表明，PE組中心肌肥大相關基因β-MHC、α-SA、ANP顯著升高（P<0.05），證明體外構建心肌肥大模型成功。結論：miR181b在心肌肥厚患者外周血中表達顯著上調；體外成功培養乳鼠原代心肌細胞，通過PE處理法成功構建體外心肌肥大模型；在肥大心肌細胞中，miR181b與prkg-1 mRNA及蛋白的表達有顯著相關性；miR181b可能通過調控prkg-1 mRNA及蛋白水平的表達參與心肌肥大，有望成為心肌肥厚臨床診斷和治療的新的靶點。

【關鍵詞】心肌肥大； 心室重構； miR181b； PRKG1

①山東省棗莊市立醫院 山東 棗莊 277100

②山東省棗莊市中醫醫院

First-author’s address： Zaozhuang Municipal Hospital， Zaozhuang 277100， China

心肌肥厚是很多慢性疾病的一個共同的臨床病理性改變，主要發生在長期壓力負荷過重的情況下，作為一種代償方式。但這種代償功能也有其不利之處，主要因為肥大的心肌需氧增加，而冠狀動脈的供血量往往不能給予滿足，造成心肌缺血，這將最后導致心肌收縮力的減退，是導致患者心衰進而引起死亡的重要原因[1]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 心肌肥大患者外周血采集 收集2012年1月-2014年3月在本院治療的50例經心臟超聲診斷有心肌肥厚的患者，男40例，女10例，年齡64～72歲，平均68.5歲，中位年齡67歲。根據高血壓臨床分級標準，50例患者經臨床診斷均為高血壓2級，病程均>5年，同時取25例健康人外周血清作為對照組。本研究經過棗莊市立醫院倫理委員會批準，并得到受試者家屬的知情同意。

1.1.2 試劑 血清RNA抽提試劑Trizol ls購自Invitrogen公司（加州、美國），組織細胞總RNA抽提試劑Trizol購自Invitrogen公司（加州、美國），兔抗鼠PKG1多克隆抗體購自Santa cruz公司（波士頓、美國），Takara PrimeScript RT Regent Kit反轉錄試劑盒（大連、中國）；TaKaRa公司SYBR PrimeScript RT-PCR Kit熒光定量（大連、中國）；L-DMEM、MCDB131、胎牛血清（FBS）：美國GIBCO公司。α-橫紋肌肌動蛋白抗體（α-sarcomeric actin antibody，α-SA），DAPI（Santa Cruz，美國）。去氧腎上腺素（PE）（Sigma-Aldrich，美國）；lipofectamine 2000購自Invitrogen （加州、美國）。

1.2 方法

1.2.1 血清總RNA提取 將患者外周血3000 r/min離心10 min，取上清；吸取血清250 μL，加入750 μL Trizol ls充分混勻，均采用酚氯仿法提取總RNA，分別通過RNA分子電泳、紫外分光光度計分析RNA 260/280比值檢測RNA質量，取總RNA 1 μL，采取PolyA加尾法對miRNA進行逆轉錄；cDNA于-20 ℃冰箱保存。相關miRNA的逆轉錄按下列程序進行，在冰上預冷的RNase free EP管中加入RNA模板6 μL，2×miRNA Reaction Buffer Mix 10 μL，0.1% BSA 2 μL，miRNA PrimeScript RT Enzyme Mix 2 μL，總體積20 μL，37 ℃孵育60 min進行PolyA加尾和反轉錄反應，隨后向上述RT反應液添加RNAase Free H2O 至100 μL，取2 μL進行定量檢測。

1.2.2 SYBR Green熒光定量PCR 熒光定量PCR技術檢測外周血中miR181b的表達水平，根據TaKaRa SYBR PrimeScript RT-PCR Kit試劑盒說明書配置反應體系：10 μL qRT-PCR-Mix，0.5 μL上游引物，0.5 μL下游引物，1 μL的cDNA 和8 μL ddH2O配置，每個樣品設3個平行孔。反應程序為：預變性95 ℃ 10 min，40個循環：95 ℃ 1 min， 60 ℃30 s溶解程序驗證特異性：95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，95 ℃ 15 s，內參基因采用U6。

1.2.3 心肌細胞的原代培養 取新生3 d的大鼠乳鼠，取出心室部位心肌組織，用眼科剪將其剪碎后，加入5 mL 0.5%胰蛋白酶和0.5%Ⅱ型膠原酶混合配成的消化液，37 ℃水浴消化5 min，取上清至含有2 mL小牛血清的離心管中，重復以上步驟2次，200 g離心5 min，棄去上清后，加入5 mL含10%胎牛血清的H-DMEM培養基，將細胞吹散并接種于25 mL培養瓶中，37 ℃，5%CO2孵箱中培養。

1.2.4 心肌細胞免疫組化 使用細胞爬片方法，制作心肌細胞切片，4 ℃下用冰丙酮固定1 h后，去離子水沖洗5 min，重復3次；用過氧化氫避光浸泡玻片20 min后，PBS沖洗兩次；滴加羊血清（1∶200），37 ℃封閉1 h。滴加稀釋的α-橫紋肌肌動蛋白抗體（1∶200），4 ℃過夜；次日PBS清洗玻片3次，滴加FITC標記兔抗大鼠2抗（1∶200），37 ℃下孵育30 min，加DAPI，孵育5 min后采用激光共聚焦顯微鏡、倒置相差熒光顯微鏡下觀察心肌細胞及熒光表達。

1.2.5 心肌肥大細胞模型的構建 心肌細胞原代培養第2天，向培養基中加入終濃度為100 μM的PE培養72 h，通過細胞免疫組化、細胞總蛋白量測定、心肌肥大相關基因檢測、流式細胞術檢測心肌細胞大小的方法對心肌肥大模型進行評估。

1.2.6 心肌細胞中miR181b與prkg1 mRNA的表達 搜集PE組及對照組心肌細胞，采用TRIzol法抽取RNA，逆轉錄為cDNA后，采用SYBR Green法檢測心肌細胞miR181b與prkg1 mRNA的表達，prkg1 mRNA的定量PCR體系按照如下標準配置：SYBR EX Taq 12.5 μL，上游引物0.5 μL，下游引物0.5μL，模板cDNA 2μL，ddH2O 10.5 μL；prkg1 mRNA 定量PCR反應條件：預變性95 ℃ 10 s；40個循環：95 ℃，5 s；60 ℃，30 s。

1.2.7 心肌細胞中PKG1蛋白的表達 收集PE組、對照組的細胞，加入RIPA裂解液裂解細胞，制備細胞蛋白上清，與2×SDS上樣緩沖液等量混合，沸水浴5 min后10 μL/孔上樣，行100 V恒壓SDS-Page電泳，300 mA恒流2 h冰浴電轉至PVDF膜，50 g/L脫脂牛奶室溫封閉1 h，加入適當濃度一抗（PKG1∶1000，GAPDH 1∶5000），4 ℃搖床孵育過夜，次日用PBST漂洗15 min×3次，加入HRP標記的二抗（羊抗鼠1∶3000，羊抗兔1∶1000）室溫孵育1 h，PBST漂洗15 min×3次，ECL發光液顯影曝光。

1.2.8 miR181b inhibitor轉染心肌細胞 采用脂質體法轉染原代心肌細胞。實驗分為對照組、NC、miRNA181b inhibitor組，均培養于不含抗生素10%胎牛血清的H-DMEM培養基，次日開始轉染，取20 pmol/μL miR181b inhibitor 1.5 μL，lipo2000 1 μL分別加入含50 μL Opti Memi培養基的EP管中靜置5 min后，將兩管混勻，室溫下靜置20 min后加入培養孔，6 h后更換10%胎牛血清的H-DMEM培養基，采用定量PCR、WB檢測48 h和72 h的各組細胞miRNA-181b及prkg1基因和蛋白PKG1表達水平；BCA法測定細胞總蛋白量、并通過流式細胞術檢測細胞大小、采用定量PCR檢測心肌肥大相關基因表達，觀察轉染前后心肌肥大的變化。

1.3 統計學處理 使用SPSS 15.0統計學軟件分析數據，計量資料用（±s）表示，比較使用成組t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 qRT-PCR檢測心肌肥大外周血中miR181b表達 使用SYBR Green法分別檢測心肌肥厚患者與健康人外周血miR181b的表達，結果顯示健康人外周血中miR181b表達（1.12±0.21），心肌肥厚組（3.35±0.22）較健康人明顯升高，比較差異有統計學意義（P<0.05）。

2.2 原代心肌細胞的培養、心肌肥大細胞模型構建及鑒定 鏡下觀察原代乳鼠心肌細胞呈典型多角形，用α-橫紋肌肌動蛋白抗體和DAPI對其進行免疫熒光染色后，在激光共聚焦顯微鏡和倒置相差免疫熒光顯微鏡下觀察，心肌細胞呈現長梭形，呈節律性的收縮，藍色為染色的細胞核，綠色熒光為細胞漿，綠色熒光細胞達到了90%以上，表明原代心肌細胞狀態好，純度高。終濃度為100 μM的PE處理原代心肌細胞72 h后，細胞免疫組化結果顯示與對照組相比，原代心肌細胞顯著肥大；PE組細胞總蛋白含量（180.22±10.21）顯著升高，比較差異有統計學意義（P<0.05）。流式細胞儀檢測顯示，PE組的心肌細胞明顯增大（P<0.05）。定量PCR檢測結果表明，PE組細胞心肌肥大相關基因β-MHC （2.92±0.41）、α-SA（3.78±0.34）、ANP（2.26±0.24）基因顯著升高，比較差異有統計學意義（P<0.05），表明體外心肌肥大細胞模型構建成功。

2.3 PE組心肌細胞miR181b與prkg1 mRNA與蛋白PKG1表達 熒光定量PCR檢測結果顯示，與對照組（1.02±0.11）細胞相比，PE組miR181b表達（3.82±0.20）顯著升高，差異有統計學意義（P<0.05）；與對照組（1.03±0.08）相比，PE 組prkg1 mRNA表達水平（0.33±0.18）明顯下調（P<0.05）。免疫印跡檢測PE組、對照組細胞PKG1蛋白（1.04±0.13）表達情況，結果顯示PE組PKG1蛋白表達（0.26±0.15）顯著降低，比較差異有統計學意義（P<0.05）。

2.4 miR181b與PKG1蛋白表達對PE組心肌細胞的影響 使用定量PCR及Western blot檢測轉染miR181b inhibitor后PE組心肌細胞中miR181b 及prkg1 mRNA和蛋白的表達，結果顯示轉染組miR181b的表達（0.25±0.14）下調，差異有統計學意義，而prkg1 mRNA（1.28±0.13）未見明顯改變；PKG1蛋白表達（3.12±0.14）顯著增高，差異有統計學意義；對轉染miR181b inhibitor的PE組心肌細胞肥大特征分析發現，miR181b表達下調后，心肌細胞總蛋白含量（138.28±15.13）下降；流式細胞術分析發現心肌細胞變小；心肌肥大相關基因β-MHC（0.58±0.16）、α-SA（0.49±0.26）、ANP （0.67±0.24）表達降低，差異有統計學意義。

3 討論

心肌肥厚（Cardiomyocyte hypertrophy）是一種強有力的代償形式，然而它不是無限度的，如果病因歷久而不能被消除，則肥大心肌的功能便不能長期維持正常而終轉向心力衰竭。目前認為，代償性心肌肥大是一種不平衡的生長形式。這種在器官、組織、細胞、分子等不同的水平上都有其特征性表現的不平衡生長[2]，是肥大心肌轉向功能不全的基礎，是大多數心血管疾病發生發展中常見的一種病理生理變化，主要是因心臟的前后負荷的改變引起心肌細胞的適應性反應，若不加以臨床治療，最終將引起心肌纖維化導致心臟衰竭的發生。

心肌肥厚發生的分子機制非常復雜，涉及到了多種基因表達及蛋白功能的改變。研究表明，在機體壓力負荷增加時，心肌細胞出現肥大改變，細胞內表現為蛋白合成增加、ATP分子合成旺盛、離子通道活性增強等[3-5]，是一種代償性的應激反應。但是若心肌細胞持續處于肥大病理狀態，會導致細胞基因表達及蛋白合成失調，線粒體、內質網等細胞器的損傷[6]，最終出現心肌細胞的死亡及間質的纖維化，導致了心臟衰竭的發生。已有文獻顯示，在心肌肥大的過程中，miRNA也起到了重要的調控作用，具有較復雜的作用機制[7]。研究表明，心肌細胞中miR-1上調能夠調節心肌組織連接蛋白43的表達，從而抑制心肌肥大[8]。另一種miRNA分子-miRNA133被證實能夠抑制腎上腺素及內皮素誘導的心肌肥大，其在肥大心肌細胞中表達下調[9]。此外文獻[10]報道，miR-98、miR-9與心肌肥大的發生發展密切相關。

綜上所述，可以認為miR181b可能通過調控prkg1基因的表達在心肌肥大過程中發揮重要作用。miR181b在心肌肥大患者外周血中表達升高；其表達下調后，原代肥大心肌細胞有逆轉的跡象，提示miR181b可能成為心肌肥厚的臨床診斷和治療上一個新靶點。

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Inhibition of miR181b by up Regulation of PKG-1 in Rats with Myocardial Hypertrophy/

YANG J un，CAO Qian， ZHONG Wei， et al.//Medical Innovation of China，2016，13（01）：008-011

【Abstract】Objective： By detecting miR181b in expression of peripheral blood in the patients with myocardial hypertrophy， mechanism research and miR181b PRKG-1 in myocardial hypertrophy， for clinical diagnosis and treatment of cardiac hypertrophy provide new targets. Method： Using quantitative real-time PCR assay for the detection of 50 cases of clinical diagnosis for the level of peripheral blood miR181b patients with hypertrophic cardiomyopathy （HCM） and 25 normal healthy patients， to analyze the relationship between the expression level and clinicopathological characteristics. Result： The expression of miR181b in peripheral blood of patients with myocardial hypertrophy （3.35±0.22） increased， the difference was statistically significant （P<0.05）；in vitro primary rat myocardial cells were polygonal in microscope， using alpha sarcomeric actin antibody andbook=9,ebook=13DAPI immunofluorescence staining， microscope 90% above cells emitted green fluorescence the results showed that the cell， high purity of primary cultured myocardial cells； using the phenylephrine treatment after 72 h， the expression of the total protein of myocardial cells significantly increased （P<0.05）； flow cytometry showed that PE group myocardial cell size increased significantly （P<0.05）； real time quantitative PCR test results showed that，PE group of Central muscle hypertrophy related genes of beta -MHC -SA， ANP， alpha significantly increased （P<0.05）， that in vitro cardiac hypertrophy model. Conclusion： miR181b in peripheral blood of patients with myocardial hypertrophy expression is significantly up-regulated； primary cultured myocardial cells of neonatal rat culture successfully in vitro， through PE treat successfully construct in vitro model of cardiac hypertrophy； in cardiac myocyte hypertrophy， miR181b and prkg-1 mRNA and protein expression have significant correlation；miR181b may by regulation prkg-1 mRNA and protein level expression in cardiac hypertrophy， is expected to become a new target for diagnosis and treatment of myocardial hypertrophy.

【Key words】Cardiac hypertrophy； Ventricular remodeling； PRKG1； miR181b

收稿日期：（2015-09-02） （本文編輯：王宇）

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.01.003

通信作者：楊軍