頂空氣相色譜法測(cè)定黃芪提取物中大孔樹脂有機(jī)溶劑殘留

蔡振華 金松子 蔣慶峰

[摘 要] 目的：建立黃芪提取物中8種大孔樹脂有機(jī)溶劑殘留物和乙醇溶劑殘留物測(cè)定方法。方法：采用DM-624毛細(xì)管氣相色譜柱，二甲基甲酰胺-水溶液為溶解介質(zhì)，氮?dú)鉃檩d氣，檢測(cè)器為氫火焰離子化檢測(cè)器（FID）。測(cè)定黃芪提取物中乙醇、正己烷、苯、甲苯、二甲苯、苯乙烯、二乙基苯、二乙烯基苯、正十二烷9種有機(jī)溶劑殘留量。結(jié)果：9種有機(jī)溶劑完全分離，精密度RSD均小于7.4%，峰面積與濃度均呈良好的線性關(guān)系，9種溶劑的平均回收率為84.6%～106.5%，其RSD<6.0%。結(jié)論：本方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、重線性好，適用于使用大孔樹脂后黃芪提取物中苯系列殘留物檢測(cè)。

[關(guān)鍵詞] 黃芪提取物；頂空氣相色譜法；大孔樹脂；殘留溶劑

中圖分類號(hào)：O657 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：2095-5200（2016）01-081-04

本品為黃芪提取物，屬于環(huán)黃芪醇（CycLoastra-genoL）類化合物，是豆科黃芪屬植物中指標(biāo)性成分類群，是常用中藥黃芪中主要生物活性成分，具有調(diào)節(jié)免疫、強(qiáng)心、抗心腦缺血損傷、保肝、抗炎、抗病毒以及改善腎臟、胰島損傷等諸多藥理作用。

在提取制備工藝過(guò)程中使用了大孔吸附樹脂。近年來(lái)，大孔吸附樹脂已廣泛用于中藥活性成分（如皂苷、總黃酮、內(nèi)酯、生物堿等大分子化合物）提取分離與純化，但大孔樹脂制造過(guò)程中，會(huì)帶來(lái)少量苯、二甲苯、苯乙烯等有害成分，從而造成被提取、純化出來(lái)提取物中含有害物質(zhì)殘留風(fēng)險(xiǎn)[1-2]。

根據(jù)中國(guó)藥典[3]和ICH（人用藥品注冊(cè)技術(shù)規(guī)范國(guó)際協(xié)調(diào)會(huì)）藥品中有機(jī)溶劑殘留量測(cè)定指導(dǎo)原則，有必要對(duì)大孔樹脂有機(jī)殘留建立檢測(cè)方法，對(duì)其殘留量加以控制。目前有關(guān)大孔樹脂有機(jī)溶劑殘留測(cè)定方法[4-7]及醇類測(cè)定方法[8-9]多數(shù)采用頂空氣相色譜法，也有采用直接進(jìn)樣氣相色譜法[10]。本實(shí)驗(yàn)建立了頂空氣相色譜法測(cè)定黃芪提取物中大孔樹脂有機(jī)溶劑殘留物以及測(cè)定提取過(guò)程中使用到乙醇?xì)埩粑锓椒ā?/p>

1 儀器與試劑

HP 6890N 氣相色譜儀，Agilent 7694E 頂空進(jìn)樣器，氫火焰離子化檢測(cè)器（FID），DM -624 毛細(xì)管柱（30.0m×0.53mm×3.00?m） （6%-氰丙基苯-94%-二甲基硅氧烷共聚物），試劑：無(wú)水乙醇、正己烷、苯、甲苯、二甲苯、苯乙烯、二乙基苯、二乙烯基苯、正十二烷、N，N-二甲基甲酰胺（均為分析純）、蒸餾水。黃芪提取物樣品（批號(hào)：20120902、20121215、20121216、20121217 ）由天津藥物研究院提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

柱溫采用程序升溫：以40℃維持2min，以6℃/min升溫速率升溫至200℃，維持2min。氣化室溫度為250℃，載氣（氮?dú)猓┝魉贋?.0 mL/min，分流比1∶1，氫火焰離子化檢測(cè)器（FID），檢測(cè)器溫度為250℃。

2.2 頂空條件

頂空平衡溫度為100℃，平衡時(shí)間30min，進(jìn)樣體積3mL。

2.3 對(duì)照品貯備液及對(duì)照品溶液配制

取無(wú)水乙醇、正己烷、苯、甲苯、二甲苯、苯乙烯、二乙基苯、二乙烯基苯、正十二烷，精密稱定，加二甲基甲酰胺制成濃度分別為2.5248?g/mL、0.0098?g/mL、

0. 0009?g/mL、0.0104?g/mL、0.0097?g/mL、0.0103?g/mL、

0.0103?g/mL、0.0101?g/mL、0.0097?g/mL溶液，作為混合對(duì)照品貯備液；精密量取此液5mL置裝有適量二甲基甲酰胺水溶液50mL量瓶中，用二甲基甲酰胺水溶液稀釋到刻度，混勻，即得對(duì)照品溶液。

稀釋劑：二甲基甲酰胺水溶液（DMF：H2O=5：2）。

2.4 專屬性

經(jīng)試驗(yàn)證實(shí)，溶劑二甲基甲酰胺水溶液不干擾待測(cè)溶劑乙醇、正己烷、苯、甲苯、二甲苯、苯乙烯、二乙基苯、二乙烯基苯、正十二烷等色譜峰，樣品中其他雜質(zhì)峰不干擾各待測(cè)溶劑峰，說(shuō)明本法專屬性強(qiáng)。見圖1。

2.5 精密度測(cè)定

取6份對(duì)照品溶液2mL分別置10mL頂空瓶中，加蓋密封。依次連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算峰面積RSD。結(jié)果：乙醇、正己烷、苯、甲苯、二甲苯、苯乙烯、二乙基苯、二乙烯基苯、正十二烷積分面積（n=6）RSD，分別為1.55%、2.73%、1.00%、2.56%、7.36%、1.97%、2.52%、4.12%、4.17%。

2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線試驗(yàn)

分別移取對(duì)照品貯備液0.5、0.8、1.0、1.2、1.5mL置10mL量瓶中，用二甲基甲酰胺水溶液稀釋到刻度，混勻，配成不同濃度對(duì)照品溶液，分別取不同濃度對(duì)照品溶液2mL置10mL頂空瓶中，加蓋密封，依次進(jìn)樣測(cè)定。以各溶劑峰峰面積（Y）對(duì)質(zhì)量濃度（X）進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見表1。

2.7 回收率試驗(yàn)

分別精密量取對(duì)照品貯備液2.0、2.5、3.0mL到裝有適量二甲基甲酰胺水溶液25mL量瓶中，用二甲基甲酰胺水溶液稀釋到刻度，搖勻，配成不同濃度對(duì)照品溶液（80%、100、120%限度）。

精密稱取9份黃芪提取物樣品（20120902）1000mg置10mL頂空瓶中，分別加入上述不同濃度對(duì)照品溶液2.0mL，加蓋密封，搖勻，作為系列回收率測(cè)試溶液，每個(gè)濃度各3份。另取1000mg黃芪提取物樣品（20120902）置10mL頂空瓶中，加二甲基甲酰胺水溶液2.0mL，加蓋密封作為樣品空白溶液。結(jié)果見表2。

2.8 檢測(cè)限及定量限

取對(duì)照品溶液用二甲基甲酰胺水溶液逐步稀釋，精密吸取2mL置10mL頂空瓶中，進(jìn)行測(cè)定，確定信噪比約為3時(shí)檢測(cè)量作為檢測(cè)限，信噪比約為l0時(shí)檢測(cè)量作為定量限。結(jié)果見表3。

2.9 樣品測(cè)定

取20120902、20121215、20121216、20121217四批樣品，精密稱取1000mg到頂空瓶中，加2mL二甲基甲酰胺水溶液溶解混勻，加蓋密封，以外標(biāo)法進(jìn)行測(cè)定。色譜圖見圖1。

四批樣品中苯、二甲苯、苯乙烯均未檢出，乙醇、正己烷、甲苯、二乙基苯、二乙烯基苯、正十二烷含量均符合中國(guó)藥典2010年版標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果見表4。

3 討論

3.1 溶劑選擇

大孔樹脂殘留物（正己烷、苯、甲苯、二甲苯、苯乙烯、1，4一二乙基苯、二乙烯基苯、正十二烷）均難溶于水，在有機(jī)溶劑中溶解性好。黃芪提取物樣品不溶于水，在二甲基甲酰胺、二甲基亞砜中易溶。根據(jù)其性質(zhì)分別考察了二甲基亞砜、二甲基乙酰胺及二甲基甲酰胺3種溶劑。

試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)采用純有機(jī)溶劑會(huì)使這些殘留物在液-氣兩相中分配系數(shù)K增加，導(dǎo)致檢測(cè)靈敏度下降。故考慮采用有機(jī)溶劑和水混合溶劑。參考有關(guān)文獻(xiàn)[6-7]，先后摸索了以下幾種混合溶劑：二甲基甲酰胺-水溶液，二甲基乙酰胺-水溶液，二甲亞砜-水溶液等系統(tǒng)。但二甲亞砜-水溶液在溫度較低時(shí)容易凝固，二甲基乙酰胺-水溶液在二乙基苯位置空白有干擾，而二甲基甲酰胺-水溶液對(duì)測(cè)定無(wú)干擾。

接著又考察DMF-水混合溶劑不同比例。在保證黃芪提取物樣品全部溶解情況下，二甲基甲酰胺-水最大比例為5：2。故選擇二甲基甲酰胺-水（5：2）混合溶液作為溶媒，既保證待測(cè)殘留物與樣品都能溶解，又增大了殘留物在頂空氣體中濃度，使分析靈敏度提高。

3.2 頂空條件選擇

由于本法同時(shí)測(cè)定9種沸點(diǎn)相差較大殘留溶劑，研究中發(fā)現(xiàn)頂空溫度和頂空加熱平衡時(shí)間對(duì)各溶劑峰峰面積影響較大，因此考察了頂空平衡溫度分別為90℃、100℃、110℃及平衡時(shí)間分別為20min，30min，40 min時(shí)各成分出峰情況，結(jié)果表明頂空平衡時(shí)間在110℃時(shí)各峰響應(yīng)最大，但樣品會(huì)產(chǎn)生分解峰干擾殘留溶劑測(cè)定；頂空平衡30時(shí)間 min和40 min時(shí)，各峰響應(yīng)接近，最終確定頂空條件為：平衡溫度100℃，平衡時(shí)間30 min。

3.3 小結(jié)

二甲苯、二乙基苯和二乙烯基苯為多種異構(gòu)體比例固定混合物， 查閱現(xiàn)有文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)二甲苯可以檢測(cè)到對(duì)二甲苯和鄰二甲苯2個(gè)峰，二乙基苯及二乙烯基苯一般只能檢測(cè)到2個(gè)峰，本文采用頂空氣相色譜法測(cè)定黃芪提取物中大孔樹脂有機(jī)溶劑殘留物，靈敏度很高，在色譜圖中二甲苯、二乙基苯和二乙烯基苯分別表現(xiàn)為2個(gè)峰、3個(gè)峰和4個(gè)峰，在計(jì)算峰面積時(shí)候以峰面積總和作為上述各溶劑峰面積進(jìn)行計(jì)算。

參 考 文 獻(xiàn)

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