IL—1β及雌激素誘導子宮內膜異位癥間質細胞Activin A及相關因子的表達

李燕　朱君

[摘 要] 目的：探討白細胞介素（IL-1β）與雌激素對子宮內膜異位癥間質細胞Activin A、Follistatin、Cripto表達的影響。方法：取25例子宮內膜異位癥手術患者增生期內膜標本，經實驗分離內膜間質細胞，分為4組，分別為IL-1β組（IL-1β500pg/mL）、雌激素組（10-6mol/L 雌激素）、IL-1β+雌激素組（IL-1β500pg/mLl與10-6mol/L雌激素）、空白對照組（FD培養液）。RT-qPCR和ELISA法，測定4組Activin A、Follistatin、Cripto的mRNA與蛋白表達。結果：IL-1β+雌激素組Activin A、Cripto mRNA表達水平較其余3組更高，差異有統計學意義（P<0.05）；Follistatin mRNA表達水平比空白對照組、雌激素組高，差異有統計學意義（P<0.05）；但與IL-1β組比較，差異無統計學意義。IL-1β+雌激素組Activin A、Follistatin 蛋白分泌比其余3組高，差異有統計學意義；Cripto蛋白分泌高于空白對照組更高（P<0.05）；但與IL-1β組、雌激素組比較，差異無統計學意義。結論：IL-1β、雌激素可對子宮內膜異位癥增生期在位內膜Activin A、Follistatin、Cripto的分泌表達產生影響。

[關鍵詞] IL-1β；雌激素；子宮內膜異位癥；Activin A；Follistatin；Cripto

中圖分類號：R711.2 文獻標識碼：A 文章編號：2095-5200（2016）01-104-03

DOI：10.11876/mimt201601034

子宮內膜異位癥是由于活性子宮內膜組織（間質和腺體）在子宮腔以外的部位出現、生長、浸潤、反復出血，患者多表現為不孕、痛經、盆腔包塊等[1]。該病發病機制目前尚不統一，主要有體腔上皮化生學說、經血逆流學說、炎癥學說等[2-4]。近年提出的在位內膜決定論認為內膜是內異癥發病基礎[5]。有研究者指出[6-7]，與正常月經周期子宮內膜Activin A及相關因子（Follistatin、Cripto）表達相比，子宮內膜異位癥在位子宮內膜存在較大差異。鑒于炎癥反應在內異癥發生中發生作用，本文選取白細胞介素（IL-1β）與雌激素，分析IL-1β與雌激素對子宮內膜異位癥間質細胞ActivinA及相關因子表達的影響。

1 材料與方法

1.1 材料來源

自新疆醫科大學第五附屬醫院2014年1月-2015年5月接診子宮內膜癥患者中取25例患者增生期內膜標本。入選標準：患者經術后病理和陰道超聲診斷，確診為子宮內膜癥；月經周期規律；術前6個月內未服用過任何激素類藥物；患者均簽訂知情同意書。入選患者年齡23～44歲，平均年齡為（32.51±2.47）歲，根據美國生育協會分期標準，9例為Ⅳ期，16例為Ⅲ期。在位子宮內膜主要通過診斷性刮宮或者宮腔鏡獲取。

1.2 儀器與試劑

電子天平（上海天平儀器廠）；高速離心機（長沙維爾康湘鷹離心機有限公司，型號：TG20-WS）；超凈工作臺（成都思博特實驗設備有限公司，型號：SJ-CJ-1FD）；顯微鏡（上海點應光學儀器有限公司，型號：DYS-809）。

F-12培養基、胎牛血清、蒸餾水、膠原酶IV、牛血清白蛋白、磷酸鹽緩沖液（PBS）、逆轉錄試劑盒、RT-PCR試劑盒、瓊脂糖、DEPC等。

1.3 實驗方法

1.3.1 子宮內膜間質細胞培養及傳代 子宮內膜標本漂洗、過濾、沉降、去除上清液，以含10%胎牛血清FD培養液培養。觀察90%左右瓶壁已經長滿了細胞，即可行傳代，采用第三代細胞完成后續試驗。

1.3.2 分組 在各子宮內膜標本內依次加入相應處理液，分別為：1）IL-1β組：加入500pg/mL濃度IL-1β；2）雌激素組：加入10-6mol/L濃度雌激素；3）IL-1β+雌激素組：向完全培養液中，加入IL-1β500pg/mL與10-6mol/L雌激素；4）空白對照組：僅10%胎牛血清FD培養液。

1.3.3 Activin A、Follistatin、Cripto測定 根據Trizol說明書行細胞總RNA提取，實時熒光定量PCR儀行熒光定量PCR擴增，ΔΔCT法進行相對定量。ELISA法測定培養液上清液中Activin A、Follistatin、Cripto蛋白水平，操作均嚴格根據試劑盒說明書要求實施。

1.4 統計學分析

本文所有統計、檢測數據均經Excel錄入并采用SPSS11.5軟件處理分析，數據均采用標準差（x±s）表示，以單因素方差分析，采用Bonferroni檢驗，并行組間比較，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 RT-qPCR測定Activin A、Follistatin、Cripto的mRNA表達水平

IL-1β+雌激素組Activin A、Cripto mRNA表達水平顯著高于其余3組，差異有統計學意義（P<0.05）；Follistatin mRNA表達水平顯著高于空白對照組、雌激素組，差異有統計學意義（P<0.05）；與IL-1β組比較，差異無統計學意義（P>0.05），見表1。

2.2 ELISA測定Activin A、Follistatin、Cripto蛋白水平

IL-1β+雌激素組Activin A、Follistatin 蛋白分泌顯著高于其余3組，差異有統計學意義（P<0.05）；Cripto蛋白分泌顯著高于空白對照組，差異有統計學意義（P<0.05）；與IL-1β組、雌激素組比較，差異無統計學意義（P>0.05），見表2。

3 討論

Activin A屬于TGF-β超家族，其在子宮內膜分化、增生、月經周期調控等各個方面均有參與，同時也是引發子宮內膜癥和推動其發展主要因子[8]。Activin A與細胞靶基因啟動子區相互結合，根據轉錄因子類型差異，實現抑制或者促進靶基因表達[9]。Rocha AL等[10]在報道中指出，Activin A是促使子宮內膜異位癥增生期在位內膜細胞增殖主要因素。除此之外，Activin A還具有促進血管內皮生長因子（VEGF）增強效果，且通過MAPK、P38依賴機制對VEGF及其受體表達進行上調，幫助血管快速形成[11]。本研究選取子宮內膜異位癥增生期內膜間質細胞，運用IL-1β以及雌激素進行作用，實驗結果顯示，Activin A mRNA與蛋白分泌與空白對照組比較，均表現出非常明顯依賴性增加，并且當其受到IL-1β與雌激素同時刺激時，Activin A mRNA與蛋白分泌表達水平，遠超過IL-1β組與雌激素組表達水平，差異有統計學意義（P<0.05）。

Follistatin是Activin A抑制因子，其通過與Activin A相互結合，對Activin A與ActRⅡ結合造成阻礙，從而達到拮抗Activin A信號通路作用[12]。已有報道證實，在腦膜炎、敗血癥等各種炎癥性疾病中，均發現有Activin A與Follistatin表達顯著增加情況[13]。Follistatin表達增加，可能僅僅致使Activin A出現負反饋調節[14]。本研究中，IL-1β與雌激素同時刺激時，Follistatin mRNA與蛋白分泌表達水平顯著高于空白對照組，但雌激素組Follistatin mRNA與蛋白分泌與空白對照組比較，差異無統計學意義（P>0.05）。這表明，雌激素并不能夠對Follistatin mRNA與蛋白分泌表達水平造成影響，估計是上述負反饋調節導致。

Cripto是一種小分子糖基磷脂酰肌醇錨定蛋白，屬于EGF-CFC家族，其是當前學界公認，參與多種腫瘤發生、發展主要因子[15]。Cripto可通過激活Wnt信號通路、激活PI3K/Akt與MAPK信號通路來促進細胞快速增殖、侵襲等，引起和推動子宮內膜異位癥變化[16]。近期有研究報道[17]，與正常月經周期子宮內膜相比，子宮內膜異位癥在位內膜增生期Cripto mRNA表達會出現明顯下降，但在分泌期卻會表現出顯著上升，這一理論提出，提出了多種因素均可對子宮內膜異位癥在位內膜增生期Cripto表達與分泌造成影響，但具體機制還需進一步深入探討。

目前，子宮內膜異位癥治療主要采用性激素抑制藥物，藥物副反應使患者生育、經期均受到影響。本研究結果發現，IL-1β與雌激素共同作用，可對Activin A、Follistatin、Cripto表達水平及蛋白分泌帶來影響。通過對Activin A、Follistatin、Cripto等因子表達和分泌進行調控，而不對雌激素水平進行抑制，是否能夠有效改善子宮內膜異位癥在位內膜細胞增殖、侵襲等，并以此實現子宮內膜異位癥治療。

參 考 文 獻

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