正電子發射斷層顯像與質譜成像互補結合尋找腫瘤相關分子標志物初探

吳培琳++賀玖明　李鐵剛　黨永紅　再帕爾·阿不力孜　朱朝暉

[摘 要] 正電子發射斷層（PET）顯像可以活體、無創反映疾病的特征分子改變，如利用18氟-脫氧葡萄糖（18F-FDG）反映腫瘤的葡萄糖代謝，以及利用18氟-硝基咪唑（18F-FMISO）反映腫瘤的乏氧狀態等。質譜成像（MSI）不需要標記和復雜準備，可以離體檢測到成百上千種分子在病灶內的精確分布信息，但這些分子的功能往往不易明確。本研究利用BALB/c裸鼠4T1乳腺癌腫瘤模型，將PET顯像和電噴霧MSI結合，通過圖像對比和統計軟件分析，分別找到了與PET糖代謝圖像和乏氧圖像匹配的系列分子，通過查找人類代謝組數據庫，初步確定了這些分子的組成。基于以上，本研究初步證實了PET顯像和質譜成像互補結合尋找特征分子標志物的可行性。

[關鍵詞] 正電子發射斷層；質譜成像；18氟-脫氧葡萄糖；18氟-硝基咪唑；分子標志物

中圖分類號：R445.6 文獻標識碼：A 文章編號：2095-5200（2016）01-001-05

盡管腫瘤是由變異的腫瘤細胞經過不斷單克隆分裂增殖生成的，但是腫瘤內部并不均勻，存在異質性。實體腫瘤血管網絡發育和分布畸形造成了微環境的差異，使得氧分壓以及細胞外酸度值呈梯度分布[1]。腫瘤細胞經過多次分裂增殖后，其子細胞呈現出分子生物學或基因方面改變，從而使腫瘤內細胞的生長速度、侵襲能力、對藥物的敏感性、預后等各方面產生差異。研究與這些特征相關的分子改變具有重要意義。

質譜成像（mass spectrometry imaging，MSI）是將質譜的離子掃描技術與成像處理軟件相結合的一種新型成像方法，具有不需要標記、無復雜的樣品前處理、可以一次提供大量分子的空間分布信息等優點。近年來，MSI技術越來越多地受到人們關注，成為成像研究領域的一個新熱點[2]。目前，迫切需要解析質譜成像所展示的豐富分子信息，確定其相關功能。

正電子發射斷層顯像（positron emission tomography，PET）是一種先進的分子影像方法，在功能、代謝、受體顯示等方面具有明顯的優勢[3-4]。例如，可以利用18氟-脫氧葡萄糖（18F-fluorodeoxyglucose， 18F-FDG）為示蹤劑揭示腫瘤各部分的葡萄糖代謝情況，以及用18氟-硝基咪唑（18F-fluoromisonidazole， 18F-FMISO）來顯示腫瘤各部分的乏氧狀態等。這一技術可以直觀、準確地顯示疾病相關的分子改變，并生成圖像。不足之處是必須引入外源標記化合物，且一次只能分析一種或有限的幾種功能分子改變。

每一種功能的改變，往往不是一種或幾種分子就可以實現，而是一系列分子改變共同組合的結果。利用分子機制已知的經典PET技術，有可能幫助剛剛起步、可能具有廣泛應用前景的MSI技術，闡明與某一功能改變相關的系列分子改變，例如找出更多的與腫瘤糖代謝或乏氧相關的分子等。

本研究擬將PET與MSI兩種分子影像方法互補結合，希望建立尋找腫瘤標志物的新方法，幫助解決臨床診斷和治療難題。

1 實驗材料與儀器

小鼠4T1乳腺癌細胞（中國醫學科學院北京協和醫學院基礎醫學研究所），用改良RPMI1640完全培養基培養；6周齡雌性BALB/c裸小鼠，體重18～20 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司[SCXK（京） 2012-0001]，在北京協和醫院動物中心無特定病原體（specific-pathogen free，SPF） 的飼養間[SYXK （京） 2010-0028]飼養。使用Siemens Inveon microPET儀進行圖像采集，其工作站配備專用圖像采集軟件和圖像分析軟件。18F-FDG和18F-FMISO均由本單位自行生產合成，放射化學純度>98%。動物麻醉使用美國Summit公司AS-1-000-7型異氟烷氣體麻醉系統，吸入麻醉劑為異氟烷（山東科源）。

腫瘤標本按一定方位用冰凍切片機（Leica CM 3050）切成8μm，置于防脫載玻片（Thermo，Superfrost plus），-80℃冰箱保存。質譜儀采用 Q-Exactive型臺式四極桿-軌道阱高分辨質譜儀 （Thermo Scientific），配有Xcalibur 2.2 數據處理系統，安裝自制的AFAI 離子源（中國醫學科學院北京協和醫學院藥物研究所天然藥物活性物質與功能國家重點實驗室），及特別編制的質譜成像分析處理軟件1.0（清華大學精密儀器與機械學系精密測試技術及儀器國家重點實驗室）。

2 實驗方法

實驗流程見圖1。

2.1 腫瘤模型的建立

細胞培養用含10%胎牛血清、100IU/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的改良RPMI1640培養基作為4T1細胞培養液，于5% CO2、37℃細胞培養箱內常規培養。收集處于生長對數期的細胞，分別稀釋至細胞數量1×108個/mL。取0.1mL 細胞懸液接種于BALB/c小鼠右側腋窩下，制作小鼠移植瘤乳腺癌模型，共接種8只。分別在接種的第1、3、5、7、9、11、13天連續觀察腫瘤的生長情況。

2.2 4T1乳腺癌移植瘤裸鼠microPET顯像及圖像分析

觀察腫瘤直徑達到9 mm左右時，連續兩天進行18F-FDG和18F-FMISO顯像。兩次顯像間隔時間大于20h。圖像采集時間設定為10 min，同位素選擇18F，其余參數選擇系統默認。數據重建用二維有序子集最大期望值法（OSEM2D），其余重建參數選擇系統默認。采集完成后，在彈出對話框內輸入放射性藥物的劑量和測量時間等，由系統自動完成重建。

2.3 取材并將腫瘤組織切成冰凍切片

荷瘤裸鼠進行兩次顯像后，立刻將其處死取腫瘤，腫瘤剝離動物體時標記部位和方向，以便于后期兩種成像方式圖像的對比。取出的腫瘤組織用錫紙包裹后放入液氮以保證腫瘤組織內的各代謝成分保持不變。最后轉移至-80℃冰箱保存。切冰凍切片前，將腫瘤組織從-80℃冰箱轉移至冷凍切片機內復溫，冷凍切片機操作溫度為-20℃。用水將組織固定在冰凍標本盤上。連續獲取相鄰5個厚度為8μm的腫瘤組織切片，分別置于5張防脫載玻片上，并對切片方向進行標記。置于-80℃冰箱保存。

2.4 乳腺癌腫瘤組織質譜成像分析與標志物的篩選

乳腺癌腫瘤組織冰凍切片，干燥器中真空干燥約30 min后用于質譜成像分析。AFAI-MSI 成像分析參數：噴霧氣流速60arb，噴霧電壓9 000 V，噴霧溶劑組成為甲醇：水 = 90：10（V/V，含0.1%甲酸），抽氣流速為45 L/min，傳輸管電壓 3 000 V。原始數據導入質譜成像軟件1.0中，在質譜圖選取某一特定質核比的離子，代入質譜成像軟件中，使其與PET圖像相一致。在此質譜成像圖上選取高分布區的5個像素點數據，同時在低分布區選取5個像素點數據。8個標本用同樣方法共選取80個像素點數據。將這80個像素點的數據做離散度分析，并作模型可信度分析，經過統計分析選出影響因子大于6且經過t檢驗P<0.001的質核比的離子作為差異離子，最終代入質譜成像軟件進行驗證并與PET圖像進行對比驗證。選出的差異離子經過數據庫（HMDB，http：//www.hmdb.ca/）檢索找出相應的潛在標志物。

3 實驗結果

3.1 腫瘤中不同區域的葡萄糖代謝和乏氧狀態不同

PET圖像分析發現，同一腫瘤中18F-FDG和18F-FMISO的攝取有明顯的分布差異。如圖2所示6只荷乳腺癌小鼠模型中，多數情況下，靠近身體或肢體的腫瘤組織18F-FDG攝取較高，而遠隔的腫瘤組織攝取相對較低，提示不同區域對葡萄糖的需求不同；而同一腫瘤中18F-FMISO的分布多位于18F-FDG攝取相對較低，但又沒有完全壞死缺失區域，提示相應區域的腫瘤細胞處于高度乏氧狀態。

3.2 初步篩選出與糖代謝相關的分子以及與乏氧相關的分子

對比兩種成像方法的圖像，初步篩選出與糖代謝高度相關分子的質荷比（m/z）為： 744.4949，744.4996， 770.5126，771.5129，771.5178，772.5248，798.5399， 799.5522，800.5499，813.5249，822.5476，825.5591。經過查找HMDB，這些質核比所對應的分子分別是：磷脂酰膽堿（PC） （30：0） /磷脂酰乙醇胺 （PE）（33：0）， 膽堿（CL）（72：7）， PC（32：1），磷脂酰甘油（PG）（34：1），PG（36：4），PC（32：0），PC（34：1），PG （38：4），PE（40：5）/PC（34：0），CL（84：15），PC（36：3），PG（40：5）。與乏氧高度相關的分子的質核比為：780.5510，804.5531，830.5648，832.5769，832.5874。經過查找HMDB，這些質核比所對應的分子分別是：PC（34：2），PC（38：7），PC（38：5），PC（38：4），PC（40：7）。圖3示例了18F-FDG PET圖像和篩選出的質譜成像圖像的比較，以及18F-FMISO PET圖像與匹配的質譜成像圖像的比較。

4 討論

Zanzonico等分析了同一腫瘤內部18F-FDG和18F-FMISO放射性攝取分布，發現二者有顯著差異，認為與腫瘤的異質性有關，并由兩種顯像劑不同的顯像原理所致[5]。18F-FDG與葡萄糖結構相近，通過細胞膜上的葡萄糖轉運體（glucose transporters， GLUTs）轉運至細胞內，在己糖激酶作用下生成18F-6-磷酸-FDG，之后便不能進一步代謝，從而滯留于細胞內，積聚數量的多少反映了腫瘤組織對葡萄糖需求的高低。本研究發現，靠近身體一側的腫瘤組織往往18F-FDG攝取較高，這是由于這一側的腫瘤更容易從身體獲得血液供應，因此營養充足，腫瘤活性較高，對葡萄糖的需求量也更大。而位于腫瘤中心部位及遠離身體的腫瘤組織，由于血供不足，缺乏用于細胞增殖的原料、能量和氧，因此糖代謝活性相對低，對18F-FDG攝取也比較少，特別是腫瘤中心部位，往往在腫瘤超過5mm后出現壞死，表現為放射性缺失[6]。

18F-FMISO可通過彌散作用進入細胞內，在細胞內黃嘌呤氧化酶作用下，其硝基發生單電子還原，產生自由基陰離子。在正常細胞中，由于氧化硝基具有更高的電子親和力，自由基陰離子被迅速氧化成原化合物，重新擴散回細胞外。當缺乏足夠的氧時，自由基陰離子被進一步還原，產物與細胞內組分結合，滯留于細胞內[7]。因此，18F-FMISO的攝取與氧分壓有很好相關性，主要濃集于供氧不足但又沒有完全壞死的區域，這與本研究觀察到的18F-FMISO多位于18F-FDG攝取相對較低但又沒有完全缺失的區域相一致。

由于Warburg效應，腫瘤細胞即使在氧供充足時，也以無氧糖酵解途徑供能。如果腫瘤組織血供充足，主要通過HIF-1途徑轉換至乏氧模式，表達包括GLUTs在內的相關分子，增強葡萄糖的攝取和糖酵解過程；如果腫瘤組織血供明顯不足，超出代償范圍，組織的乏氧進一步增強HIF-1活性，使腫瘤細胞表達VEGF和COX2等分子，并增強腫瘤的侵襲、轉移和對放化療的抵抗能力[8]。深入研究相關分子改變有助于進一步理解腫瘤的發生、發展機制，以及尋找相關的分子標志物，為臨床分子診斷及靶向治療提供依據。

20世紀90年代末，代謝組學繼基因組學、蛋白質組學之后逐漸興起[9]，包括脂質代謝組學、糖類代謝組學、毒素代謝組學等[10]。其中，脂質代謝組學作為重要的代謝組學分支，逐漸成為研究的熱點[11]。

近年來，研究脂質代謝組學的方法和技術也取得了突破性進展，如薄層色譜法、氣相色譜-質譜聯用法、電噴霧電離質譜法、基質輔助激光解吸附電離飛行時間質譜法等[12]。隨著分子影像興起，以各種質譜技術為基礎的成像方法也不斷發展。Chughtai等人檢測到在MDA-MB-231乳腺癌供氧豐富的區域分布有質荷比為772.5的分子并用MS/MS質譜分析法驗證了質荷比為772.5的結構是PC（32：0）[13]，Seiji Ishikawa等人研究發現在甲狀腺乳頭狀癌中質荷比為772.5的分子含量低于正常甲狀腺組織。同時他們也發現質荷比為798.5的分子在甲狀腺癌含量增高，并證實了其為PC（34：1） [14]。另外，一項有關腺淋巴瘤內PC分布的研究報道了在腺淋巴瘤區域，質荷比為772.5和822.5的分子具有高豐度，并通過串聯質譜法驗證了這些分子分別為PC（32：0）， PC（36：3）[15]。以上研究是將病理的方法與質譜成像結合，找出腫瘤與非腫瘤區域的分子分布差異，是組織水平與分子水平的對比。本研究則探索了將活體的PET顯像和離體的質譜成像兩種分子影像方法結合起來，選出了一批與糖酵解和乏氧相關的脂質分子，其中以上報道的PC（32：0）、PC（34：1） 和PC（36：3）赫然在列，與腫瘤的糖代謝增高相關，此外還發現另外9種與糖代謝高度相關及5種與乏氧高度相關分子。以上初步證明，基于PET顯像尋找和分析MSI中腫瘤相關分子標志物是合理可行的。