電針百會(huì)透曲鬢穴對(duì)急性腦出血大鼠蛋白酶激活受體-1表達(dá)的影響

王 艷

電針百會(huì)透曲鬢穴對(duì)急性腦出血大鼠蛋白酶激活受體-1表達(dá)的影響

王 艷

目的 探討電針百會(huì)透曲鬢穴對(duì)急性腦出血大鼠模型的神經(jīng)功能缺損及血腦屏障(BBB)通透性的影響及其機(jī)制。方法 將SD雄性大鼠隨機(jī)分為3組：假手術(shù)組、模型組、電針組，每組根據(jù)6 h、1 d、3 d、7 d不同時(shí)間點(diǎn)分為4個(gè)亞組。尾狀核內(nèi)注射Ⅶ型膠原酶制作腦出血模型。腦出血術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分；通過測(cè)量腦組織伊文思藍(lán)(EB)含量來測(cè)量BBB通透性；免疫組化和熒光實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)蛋白酶激活受體-1(PAR-1)表達(dá)變化。結(jié)果 電針治療可顯著改善模大鼠在腦出血后6 h、1 d、3 d、7 d各時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)功能缺損評(píng)分和腦組織EB含量，電針治療組與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；免疫組化及熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)顯示腦出血后PAR-1的表達(dá)，電針治療組與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 電針百會(huì)透曲鬢穴可改善急性腦出血神經(jīng)功能缺損癥狀，降低BBB通透性，其作用機(jī)制可能與減少出血灶周腦組織PAR-1的表達(dá)有關(guān)。

腦出血；電針；百會(huì)；蛋白酶激活受體-1；血腦屏障

頭針(scalp acupuncture，SA)是指利用毫針去穿刺刺激頭皮的特定區(qū)域，是在傳統(tǒng)針灸理論的基礎(chǔ)上，結(jié)合現(xiàn)代解剖學(xué)、神經(jīng)生理學(xué)和全息生物學(xué)發(fā)展起來的[1]。有相關(guān)系統(tǒng)評(píng)價(jià)表明，SA可以有效改善急性腦出血病人的神經(jīng)功能缺損癥狀[2]。其中，百會(huì)穴是督脈上最重要的穴位之一，它位于人頭頂?shù)淖罡唿c(diǎn)，所有的陽經(jīng)匯集于此。最新磁共振3D重建技術(shù)顯示，百會(huì)穴位于額葉中央前溝前部[3]。針灸百會(huì)穴能提神醒腦，滋陰補(bǔ)陽，補(bǔ)腎固澀，祛除內(nèi)風(fēng)，促進(jìn)復(fù)蘇。因此，針灸百會(huì)穴特別適用于治療腦中風(fēng)等神經(jīng)系統(tǒng)疾病，且已有研究表明，百會(huì)穴(GV20)是SA治療急性腦出血非常關(guān)鍵的穴位[4]。

蛋白酶激活受體(protease activated receptors，PARs)，是一種經(jīng)典的七次跨膜G蛋白偶聯(lián)受體，有7個(gè)疏水的螺旋狀跨膜區(qū)域，從而形成3個(gè)胞外環(huán)狀結(jié)構(gòu)和3個(gè)胞內(nèi)環(huán)狀結(jié)構(gòu)。目前已知的PARs有四種：PAR-1、PAR-2、PAR-3、PAR-4[5]。其中PAR-1、PAR-2、PAR-3由凝血酶激活，PAR-2由胰蛋白酶或胰島素樣蛋白酶激活。其中PAR-1主要分布在神經(jīng)系統(tǒng)中，以神經(jīng)元、星型膠質(zhì)細(xì)胞為主[6]。PAR-1被作為第一信號(hào)分子凝血酶激活后，啟動(dòng)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)發(fā)揮作用。有腦出血后早期腦水腫可能是凝血酶激活PAR-1引起神經(jīng)的軸突、樹突和膠質(zhì)細(xì)胞的突起回縮，造成細(xì)胞損傷；后期腦水腫主要是由于凝血酶通過激活PAR-1使毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生收縮，細(xì)胞間隙增大，緊密連接開放導(dǎo)致血腦屏障(BBB)破壞，BBB通透性明顯增高可使腦水腫明顯加重[7]。 因此，本研究旨在探討電針百會(huì)透曲鬢穴治療急性期腦出血大鼠的療效及對(duì)PAR-1表達(dá)的影響，以期為針灸治療腦出血提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 成年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠108只，體重250 g～300 g。采用完全隨機(jī)的方法分為3組：假手術(shù)組、模型組、電針組。除假手術(shù)組外，每組依據(jù)不同時(shí)間點(diǎn)分為4個(gè)亞組，即6 h、1 d、3 d、7 d組，每個(gè)亞組取12只大鼠。

1.2 腦出血模型的制備 參照Rosenberg方法[8]，將大鼠用10%水合氯醛(400 mg/kg)腹腔注射麻醉，俯臥位固定于立體定位儀上，頭頂剪毛，常規(guī)消毒，正中切口，骨膜剝離器剝離骨膜，暴露前囟及冠狀縫，以前囪為坐標(biāo)原點(diǎn)，向右旁開2.9 mm，向后0.2 mm確定注射點(diǎn)坐標(biāo)，用牙科鉆在顱骨表面鉆直徑為0.8 mm的圓孔，穿透顱骨但不傷及腦組織，用固定在立體定向儀上的5 μL微量注射器(針頭直徑0.7 mm)沿鉆孔進(jìn)針垂直插入腦組織6 mm，到達(dá)尾狀核位置，10 min緩慢勻速注入含0.6 U/μL Ⅶ型膠原酶的生理鹽水(normal saline，NS)3 μL，留針10 min，然后緩慢出針，用骨蠟封閉顱骨上的鉆孔，縫合切口。 假手術(shù)組：不注射膠原酶，其余操作同模型組。

1.3 電針治療方法 參照華興幫等制定的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物穴位圖譜》，定位“百會(huì)”和“曲鬢”穴。將大鼠固定于實(shí)驗(yàn)架上，在百會(huì)穴位處常規(guī)消毒，選用30號(hào)2.5 cm不銹鋼毫針，快速刺入皮下并斜向右下方達(dá)曲鬢穴，針刺方法參照《常用動(dòng)物動(dòng)物腧穴圖譜》標(biāo)準(zhǔn)。將一塊生理鹽水濕潤(rùn)的紗布綁在大鼠尾巴根部，另一根毫針插在此紗布中。將G6805-2型電針治療儀正極接百會(huì)穴毫針，負(fù)極接大鼠尾巴毫針，連續(xù)波，頻率2 Hz，強(qiáng)度0.2 mA，留針30 min。電針治療組于造模后6 h開始治療，每天進(jìn)行電針治療1次。模型組只是固定于實(shí)驗(yàn)架上30 min，不進(jìn)行任何治療。假手術(shù)組不進(jìn)行任何電針處理。

1.4 神經(jīng)功能缺損評(píng)分 各組大鼠造模術(shù)后，待大鼠清醒，分別于術(shù)后6 h、1 d、3 d、7 d采用Longa五級(jí)評(píng)分法[9]，進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分。術(shù)后6 h評(píng)分為1分～3分的視為成功模型。具體評(píng)分如下，0分：無神經(jīng)功能缺損癥狀；1分：提尾時(shí)病灶對(duì)側(cè)前肢不能完全伸展，為輕度缺損癥狀；2分：行走時(shí)向病灶對(duì)側(cè)轉(zhuǎn)圈，為中度缺損癥狀；3分：行走時(shí)向病灶對(duì)側(cè)跌倒，為重度缺損癥狀；4分：無自發(fā)性活動(dòng)，伴意識(shí)障礙。

1.5 伊文思藍(lán)(evans blue，EB)測(cè)定血腦屏障通透性 在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)處死的前90 min，進(jìn)行腹腔麻醉大鼠，經(jīng)股靜脈注射2% EB生理鹽水溶液(4 mL/kg)，注射成功后可見大鼠眼睛及四肢迅速變藍(lán)，90 min后開胸，分離心包膜，從左心室插管，插管成功后用動(dòng)脈夾固定，進(jìn)行生理鹽水快速灌注，剪破右心耳，直到右心耳流出清亮的液體后停止灌注，每只模型需200 mL～250 mL生理鹽水。迅速斷頭取腦，將腦組織分成左右兩半，稱重后分別放入3 mL的甲酰胺溶液中，60 ℃恒溫水浴箱中放置24 h，腦組織顯現(xiàn)為無色透明狀，各管甲酰胺溶液為深淺不同藍(lán)色，取出腦組織后5000r/min離心甲酰胺溶液20 min，取上清液再10000 r/min離心10 min，取上清液用多功能酶標(biāo)儀在632 nm波長(zhǎng)測(cè)甲酰胺中EB的OD值，用純甲酰胺溶液作對(duì)照組。計(jì)算腦組織中EB含量公式：腦組織中EB含量(μg/g腦濕重)=標(biāo)準(zhǔn)品EB含量(μg/mL)×甲酰胺量(mL)÷腦濕重(g)，其中標(biāo)準(zhǔn)品EB含量(μg/mL)用標(biāo)準(zhǔn)曲線直線回歸方程求出。

1.6 PAR-1檢測(cè)

1.6.1 免疫組化 各組大鼠在出血后不同時(shí)間點(diǎn)給予水合氯醛深度麻醉，迅速打開胸腔，經(jīng)左心室灌注磷酸鹽緩沖生理鹽水(PBS 0.01 mol/L，pH7.4)50 mL沖洗血管，繼之以200 mL磷酸緩沖液(PBS 0.01 mol/L，pH7.4)配制的含4%多聚甲醛固定液灌注固定腦組織，斷頭取腦，置于中性甲醛溶液中固定。標(biāo)本經(jīng)脫水，石蠟包埋，在切片機(jī)上連續(xù)切片，片厚3 μm，作免疫組化染色。按試劑公司推薦三步法操作。為確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的真實(shí)性和客觀性，染色結(jié)果判定由專人單盲閱片。PBS代替一抗作空白對(duì)照，用已知陽性標(biāo)本作陽性對(duì)照。在用OlympusCH2型顯微鏡(10×20倍)下，隨機(jī)取每張腦片6個(gè)不重疊視野，計(jì)數(shù)PAR-1陽性細(xì)胞數(shù)。

1.6.2 熒光實(shí)時(shí)定量PCR 采用Trizol一步法從血腫周圍腦組織中提取總RNA，行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，用紫外分光光度儀檢測(cè)RNA 純度。然后取4 μL 總RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶及隨機(jī)引物等反應(yīng)物混合配成20 μL體系，42 ℃ 15 min，95 ℃ 2 min 反轉(zhuǎn)錄成cDNA，隨后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量RCR 反應(yīng)，大鼠PAR-1 引物序列：上游引物5′- CTCAGCCTGTGCGGTCCT-3′，下游引物 5′- AAGTAGACTGCCCTGCCCTC-3，擴(kuò)增片段206 bp；以大鼠β-actin基因?yàn)閮?nèi)參照，引物序列為： 上游：5′-GAGAGGGAAATCGTGCGTGAC-3′，下游5′-CCATACCCAGGAAGGAAGGCT-3′，擴(kuò)增片段206 bp。實(shí)時(shí)熒光定量PCR產(chǎn)物利用公司自帶的系統(tǒng)軟件分析，可觀察擴(kuò)增曲線，并對(duì)cDNA的含量進(jìn)行定量分析，計(jì)算樣本的△△Ct值。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分 模型組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分6 h即開始升高，1 d達(dá)到高峰，隨后開始降低，在術(shù)后7 d仍高于正常水平。電針治療組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分與模型組呈相同的變化趨勢(shì)，1 d神經(jīng)功能缺損評(píng)分最高，隨后開始降低，7 d稍高于正常水平。模型組與電針治療組大鼠在腦出血后6 h、1 d、3 d、7 d比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表1。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分(±s) 分

2.2 腦出血后大鼠血腦屏障通透性 假手術(shù)組、電針治療組與模型組大鼠相比，術(shù)側(cè)腦組織EB含量在腦出血后6 h、1 d、3 d、7 d時(shí)間點(diǎn)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；電針治療組與假手術(shù)組EB含量在腦出血后6 h、1 d時(shí)間點(diǎn)比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表2。

表2 各組大鼠腦組織EB含量(±s) μg/g

2.3 免疫組化檢測(cè)PAR-1的表達(dá) PAR-1蛋白的表達(dá)陽性細(xì)胞染色主要在胞膜、胞漿，可清楚分辨胞核的形態(tài)。正常大鼠大腦PAR-1蛋白表達(dá)輕度陽性，模型組6 h時(shí)PAR-1表達(dá)強(qiáng)度開始增強(qiáng)，24 h時(shí)PAR-1表達(dá)進(jìn)一步增加，3 d時(shí)表達(dá)亦較為強(qiáng)烈，然后開始下降，7 d時(shí)明顯下降，向假手術(shù)組水平靠近。在6 h、24 h、3 d及7 d各時(shí)間點(diǎn)，模型組和電針組的PAR-1陽性細(xì)胞數(shù)與假手術(shù)組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，電針治療組與假手術(shù)組的PAR-1陽性細(xì)胞數(shù)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表3。

表3 電針對(duì)PAR-1陽性細(xì)胞數(shù)時(shí)間變化趨勢(shì)的影響(±s)

2.4 熒光實(shí)時(shí)定量PCR測(cè)定PAR-1mRNA的表達(dá)變化 PAR-1模型組在6 h表達(dá)開始上升，1 d時(shí)進(jìn)一步表達(dá)增加，3 d仍處于較高水平隨后又下降，7 d時(shí)仍高于正常水平。模型組與假手術(shù)組比較在各時(shí)間點(diǎn)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，電針治療組與模型組比較在各時(shí)間點(diǎn)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表4。

表4 熒光實(shí)時(shí)定量PCR測(cè)定PAR-1mRNA的表達(dá)(±s)

3 討 論

1990年，Rosenberg等[8]第一次采用注入膠原酶方法在SD大鼠身上成功制成腦出血?jiǎng)游锬Ｐ汀Ｄz原酶是一組可以特異降解基底膜和間質(zhì)膠原成分的金屬基質(zhì)蛋白酶，分Ⅰ型～Ⅷ型，最常使用來制備腦出血?jiǎng)游锬Ｐ偷氖洽粜图阿餍湍z原酶。RoSenberg模型，利用腦立體定位儀，9 min內(nèi)向大鼠尾狀核內(nèi)注入2 μL含有0.01～0.1單位Ⅺ型或Ⅶ型膠原酶的生理鹽水，注射10 min即可觀察到腦出血及水腫的形成。此方法制造的模型很好地模擬了自發(fā)性腦實(shí)質(zhì)內(nèi)出血的發(fā)生和血腫的擴(kuò)大，以及腦水腫的形成[10]。本實(shí)驗(yàn)研究中采用膠原酶誘導(dǎo)法制造腦出血大鼠模型，利用腦立體定位儀向模型大鼠腦尾殼核注入Ⅶ型膠原酶。大鼠腦內(nèi)最大的核團(tuán)是尾殼核，立體定位非常容易，尾殼核最容易發(fā)生自發(fā)性腦出血，因此選用尾殼核定位。術(shù)后的大鼠都出現(xiàn)了不同程度的神經(jīng)功能缺損癥狀，證明動(dòng)物模型成功。大鼠腦出血模型制作成功后，會(huì)出現(xiàn)病灶對(duì)側(cè)肢體不同程度偏癱、無力等神經(jīng)功能缺損癥狀。本實(shí)驗(yàn)采用經(jīng)典的Zea Longa五分制評(píng)分方法[9]，結(jié)果顯示：模型組在腦出血后6 h神經(jīng)功能缺損評(píng)分即開始升高，在1 d達(dá)到高峰，隨后開始下降。電針治療組與模型組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明電針百會(huì)透曲鬢穴在腦出血急性期能改善神經(jīng)功能缺損癥狀，有明顯的治療效果。

BBB存在于腦組織與血液之間，是由無窗孔的毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞的足突和基底膜組成的復(fù)合體，結(jié)構(gòu)復(fù)雜。生理情況下，BBB對(duì)水分子高度通透，使腦脊液以自由擴(kuò)散方式與腦、脊髓進(jìn)行持續(xù)交換，維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和大腦功能的正常行使。伊文思藍(lán)是一種偶氮基熒光染料，作為常用的BBB的示蹤劑，分子量為960.81，可以結(jié)合血清蛋白，形成蛋白質(zhì)復(fù)合物，在血腦屏障破壞時(shí)或通透性增加時(shí)，通過間隙滲入到組織。有研究報(bào)道[11]，在組織間隙中EB的量與BBB通透性成正比，即BBB破壞越嚴(yán)重組織間隙中EB的量越多。因此，目前已有不少實(shí)驗(yàn)研究采用測(cè)量腦組織EB含量的方法來了解腦出血后BBB通透性改變的情況，且研究表明，腦組織EB含量在腦出血后明顯升高，并在腦出血后1 d達(dá)到高峰期[12-14]。 本課題用多功能酶標(biāo)儀測(cè)腦組織中所含EB的OD值，從而算出EB的含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，腦出血后6 h腦組織EB含量即明顯升高，并在腦出血后1 d達(dá)到高峰期。電針治療組與模型組相比在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明電針百會(huì)透曲鬢穴在腦出血急性期能降低BBB通透性，減輕BBB損傷。

腦出血后，腦水腫包括血管源性和細(xì)胞毒性水腫，新近的研究表明凝血酶在腦出血后腦水腫的發(fā)生中起關(guān)鍵的作用，早期腦水腫(出血24 h以內(nèi))是由于凝血酶對(duì)腦細(xì)胞毒性作用，后期(出血24 h以后)則是由于凝血酶造成的血腦屏障破壞，但其形成機(jī)制亦尚未完全闡明[15]。在正常情況下，通過凝血酶影響的大多數(shù)的細(xì)胞功能是由PARs介導(dǎo)的，在病理情況下，細(xì)胞外的凝血酶的重要性在于介導(dǎo)腦缺血的、出血的和外傷的損害。凝血酶在腦消除緩慢，其可能有特別地強(qiáng)大的和延長(zhǎng)的效應(yīng)[16]。本研究結(jié)果顯示，腦出血后PAR-1的表達(dá)增加，提示PAR-1的激活可能在腦出血后腦水腫產(chǎn)生和發(fā)展過程中起重要作用，從血腫逐漸釋放出的凝血酶可能通過不斷激活PAR-1而導(dǎo)致腦損傷。而電針組可顯著下調(diào)PAR-1的表達(dá)，表明電針百會(huì)透曲鬢穴在腦出血急性期可能通過降低PAR-1的表達(dá)，從而發(fā)揮保護(hù)腦組織的作用。

[1] Liu Z，Guan L，Wang Y，et al.History and mechanism for treatment of intracerebral hemorrhage with scalp acupuncture[J].Evid Based Complement Alternat Med，2012，2012：895032.

[2] Zheng GQ，Zhao ZM，Wang Y，et al.Meta-analysis of scalp acupuncture for acute hypertensive intracerebral hemorrhage[J].Journal of Alternative and Complementary Medicine， 2011，17：293-299.

[3] Shen EY，Chen FJ，Chen YY，et al.Locating the acupoint baihui(GV20) beneath the cerebral cortex with MRI reconstructed 3D neuroimages[J].Evid Based Complement Alternat Med，2011，2011：362494.

[4] Li HQ，Li JH，Liu AJ，et al.GV20-based acupuncture for animal models of acute intracerebral haemorrhage：a preclinical systematic review and meta-analysis[J].Acupunct Med，2014，32(6)：495-502.

[5] Ayala YM，Cantwell AM，Rose T，et al.Molecular mapping of thrombin-receptor interactions[J].Proteins，2001，45(2)：107-116.

[6] Bartha K，D?m?t?r E，Lanza F，et al.Identification of thrombin receptors in rat brain capillary endothelial cells[J].J Cereb Blood Flow Metab，2000，20(1)：175-182.

[7] Lee KR，Kawai N，Kim S，et al.Mechanisms of edema formation after intracerebral hemorrhage：effects of thrombin on cerebral blood flow，blood-brain barrier permeability，and cell survival in a rat model[J].J Neurosurg，1997，86(2)：272-278.

[8] Rosenberg GA，Mun-Bryce S，Wesley M，et al.Collagenase-induced intracerebral hemorrhage in rats[J].Stroke，1990，21(5)：801-807.

[9] Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J].Stroke，1989，20(1)：84-91.

[10] Andaluz N，Zuccarello M，Wagner KR.Experimental animal models of intracerebral hemorrhage[J].Neurosurg Clin N Am，2002，13(3)：385-393.

[11] Migliati E，Meurice N，DuBois P，et al．Inhibition of aquaporin-1 and aquaporin-4 water permeability by a derivative of the loop diuretic bumetanide acting at an internal pore-occluding binding site[J]．Mol Pharmacol，2009，76：105-112.

[12] Shi W，Wang Z，Pu J，et al.Changes of blood-brain barrier permeability following intracerebral hemorrhage and the therapeutic effect of minocycline in rats[J].Acta Neurochir Suppl，2011，110(Pt2)：61-67.

[13] Manaenko A，F(xiàn)athali N，Khatibi NH，et al.Arginine-vasopressin V1α receptor inhibition improves neurologic outcomes following an intracerebral hemorrhagic brain injury[J].Neurochem Int，2011，58(4)：542-548.

[14] Zhou QB，Jin YL，Jia Q，et al.Baicalin attenuates brain edema in a rat model of intracerebral hemorrhage[J].Inflammation，2014，37(1)：107-115.

[15] Xi G，Reiser G，Keep RF.The role of thrombin and thrombin receptors in ischemic，hemorrhagic and traumatic brain injury：deleterious or protective? [J].J Neurochem，2003，84：3-9.

[16] Xi G，Hua Y，Keep RF.Induction of colligin may attenuate brain edema following intracerebral hemorrhage[J].Acta Neurochir，2000，76：501-505.

(本文編輯郭懷印)

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