循環腫瘤細胞在非小細胞肺癌診療中的應用進展

干爭光綜述，羅　以審校（.南華大學，湖南衡陽4200；2.湖南省腫瘤醫院老干頭頸內科，長沙40005）

循環腫瘤細胞在非小細胞肺癌診療中的應用進展

干爭光1綜述，羅以2△審校
（1.南華大學，湖南衡陽421001；2.湖南省腫瘤醫院老干頭頸內科，長沙410005）

肺腫瘤；癌，非小細胞肺；血液循環；綜述

肺癌的發病率逐年升高，發病率及病死率均居于惡性腫瘤首位，非小細胞肺癌（NSCLC）占所有肺癌的85%左右［1］。因肺癌早期癥狀不明顯，發現時多已晚期，5年生存率僅15%［2］。因此，亟待一種行之有效的方法來提高早期診斷率、預測轉移和復發，并實時監測療效，以提高總體治愈水平。眾所周知，惡性腫瘤的一個重要特征是復發和轉移。循環腫瘤細胞（CTCs）與腫瘤遠處轉移關系密切，在腫瘤轉移的環節中有極其重要的作用。因此，對肺癌患者檢測CTCs具有重要價值。本文對NSCLC診療中CTCs的應用作如下綜述。

1　CTCs概述

1869年，Thomas Ashwoah首次提出CTCs的概念［3］。目前，人們將CTCs定義來源于實體瘤本身或轉移灶腫瘤細胞，通過不同途徑釋放進入血液循環，自發產生或診療操作所致［4］。來源于惡性腫瘤原發部位的腫瘤細胞，通過細胞周期不斷增殖、上皮間質轉化（EMT）［5］，發生一系列分子表型改變，極具侵襲性，從而容易進入循環系統，CTCs聚集成團形成微小癌栓，定植于不同的組織器官中，在一定條件下發展為轉移灶。CTCs具有以下特點：（1）CTCs數量少，機體免疫機制等因素使得進入血液循環中的CTCs被大量吞噬、滅活；105～107個外周血單核細胞大約僅存在一個CTC［6］，在疾病的早期階段甚至更低。（2）CTCs源于實體腫瘤，腫瘤具有異質性的特點：①遺傳上具有異質性，CTCs雖然與原發腫瘤具有基因組同源性，但與腫瘤原發部位細胞存在著異質性；②CTCs在標記基因的表達上存在差異，因EMT等原因的存在，使CTCs在不同程度上具有間質細胞和上皮細胞2種細胞的特征；③CTCs在形態學上具有差異性，CTCs屬于腫瘤細胞，腫瘤細胞具有形態上的異質性。（3）因細胞親和力的存在，多個CTCs有聚集成團的傾向，容易形成循環腫瘤微栓（CTM），這多見于 NSCLC［7］。因為CTCs具有上述特點，導致了檢測CTCs存在較大困難，CTCs的研究進展緩慢。伴隨著檢測技術的進步及人們對CTCs了解的不斷加深，CTCs逐漸成為研究熱點。

2　CTCs的檢測方法

CTCs罕見于腫瘤患者外周血液中，檢測要求敏感性極高、精確性高，能對CTCs準確定量。目前CTCs檢測有較多的方法，一般以以下幾種檢測方法最常見。

2.1基于腫瘤免疫學原理的分離、檢測方法這種方法基于抗原-抗體反應的原理，是目前檢測方法使用最普遍的一種。因CTCs是來源于上皮源性原發腫瘤或其轉移灶，具有上皮細胞的特征。上皮特異性細胞黏附分子（EpCAM）在上皮組織表面廣泛表達，因此常被用作CTCs的檢測標志。目前最常見的CellSearch系統，由美國食品藥物管理署批準進入臨床，用來預測轉移性乳腺癌、前列腺癌和結直腸癌患者的無疾病進展生存時間（PFS）和總生存時間（OS）。在該系統的檢測試劑盒中，含有一種基于鐵磁流體的捕獲試劑盒免疫熒光試劑，在磁芯的聚合層上涂有針對EpCAM抗原的抗體，以捕獲CTCs。該檢測方法具有高敏感性及高效性的特點，但因為腫瘤細胞EMT的存在，癌細胞部分丟失了上皮細胞特異性標志物（如EpCAM等），并部分具有間質細胞的特征，如表達鈣黏附素等［7］，并且不是所有上皮細胞腫瘤中EpCAM都有表達（如惡性黑色素瘤），因此常存在漏檢的可能，且設備昂貴，不利于廣泛應用。

2.2基于細胞大小的分離、富集方法（ISET）該檢測方法基于細胞物理學及形態學特性來區分腫瘤細胞，CTCs形態較正常血細胞偏大。因此，使ISET分離富集成為可能。該方法原理簡單，易于操作，對設備要求不高，并可避免基于依靠EpCAM標記檢出率低的缺陷，使檢出率大大提高［8］。但由于借助細胞形態學進行細胞分離，因此篩選不具特異性［9］，且很大限度上依賴病理學家的經驗，有一定局限性。

2.3流式細胞術（FCM）FCM是20世紀70年代發展起來的一種基于免疫學原理的方法，將腫瘤細胞特異標志與攜帶熒光物質的抗體進行結合標記，然后將標記的腫瘤細胞通過流式細胞儀來進行鑒定分析，可以快速測量腫瘤細胞結構的分析和分選，但FCM也存在效率及敏感性較低的不足。

2.4通過核酸來檢測CTCs目前，最常用的核酸檢測方法是逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）。因正常的血細胞中不存在腫瘤細胞的某些基因或表達的信使RNA，因此血液中檢測出這些DNA或RNA可間接提示CTCs的存在［10］。但由于mRNA易降解、受擴增效率和非特異性擴增的影響，易出現假陽性的結果。且該方法檢測是用核酸來推測CTCs的存在，可能造成檢測量與CTCs實際水平存在差距［11］。

3　CTCs與NSCLC

3.1CTCs與早期NSCLC診斷治療NSCLC的診斷時期決定了治療方法及患者的預后，早期診斷是治愈患者的關鍵。目前NSCLC早期診斷主要依賴于影像學檢查，但對直徑小于5 mm的腫塊難以發現。Bevilacqua等［12］表明，通過影像學檢查診斷為Ⅰ期肺癌患者，其血液中檢測到了CTCs，說明腫瘤細胞的播散在疾病早期可能就已經發生。Kurusu等［13］也在早期肺癌患者中檢測到了CTCs，并發現部分手術患者的局部復發和遠處轉移在短時間內就出現，提示遠處微轉移病灶可能已經存在。據統計，經手術根治治療的Ⅰ期NSCLC患者，其5年復發轉移率超過30%［14］，且多為全身性播散轉移，進一步提示以影像學為基礎分期的早期肺癌可能已經存在遠處瘤細胞微轉移的發生。從某種程度上來說，在NSCLC早期診斷中CTCs敏感性可能更高。

3.2CTCs與NSCLC的分期目前實體瘤的分期仍依據TNM分期來進行，主要包括腫塊大小、區域淋巴結轉移、遠處轉移，主要通過影像學來指導腫瘤的分期?，F有研究認為，腫瘤的TNM分期與CTCs的檢出具有一定相關性，CTCs數量水平與實體瘤TNM分期有較高的一致性。Kerbs等［15］選取了Ⅲ期和Ⅳ期NSCLC患者行CTCs計數，發現Ⅳ期患者CTCs數量為0～146個，明顯高于ⅢB期（0～3個）和ⅢA期（0個）。陳燕等［16］研究了不同分期的NSCLC，發現CTCs數量在Ⅲ、Ⅳ期明顯高于Ⅰ、Ⅱ期。目前廣泛應用影像學檢查顯示的腫塊大小，在某些情況下不能完全反映腫瘤的浸潤能力。因此，CTCs在一定程度上可以彌補影像學的不足，并與影像學緊密結合以指導腫瘤分期，為患者制訂切實可行的治療方案提供依據。有研究表明，術前或者術后血液中CTCs水平較高的患者，術后的遠期生存率就比較差，提示臨床上一些按常規影像學數據來判定為早期肺癌患者，實際上并非為早期［13］。目前按早期肺癌患者所采取的常規治療措施，可能嚴重影響早期肺癌的治療效果及預后。因此，通過CTCs的檢測，可以在某些早期肺癌術后患者中，采取術后輔助化療或者靶向治療，以提高療效及遠期生存率。

3.3CTCs與NSCLC的療效評價由于肺癌患者早期無明顯癥狀和體征，目前絕大多數NSCLC診斷明確時已處于晚期，喪失了手術治療的機會。而化療、放療及分子靶向綜合治療成為主要治療手段。目前肺癌患者療效評價仍采用實體瘤RECIST評價標準，分為完全緩解（CR）、部分緩解（PR）、穩定（SD）及進展（PD）。研究表明，臨床上療效評價為CR、PR的患者，外周血CTCs較化療前下降，提示CTCs的變化與實體瘤評價存在較高的一致性，治療期間CTCs數量的變化與治療應答相關。李晶等［17］選取中晚期NSCLC患者分別于化療前、2周期化療后檢測CTCs，每2個周期行療效評估，結果提示CTCs數目評價與RECIST評價療效比較，差異無統計學意義（P＞0.05），顯示2種評價方法有較高的吻合度。Punnoose等［18］研究發現，在化療后產生應答，PET/CT提示腫塊縮小，腫瘤代謝減低，同時檢測化療前、后患者的CTCs水平，治療有效應答的患者其CTCs水平較化療前下降，表明CTCs檢測與PET/CT相吻合，且這部分患者PFS較長。通過CTCs的變化，來明確治療的有效性，指導治療方案的實施，提高療效。同時，CTCs檢測具有易于操作性和可重復性的特點，具有動態性及實時性的優點。

3.4CTCs與NSCLC預后腫瘤的預后，由多種因素決定，但研究表明，患者預后與CTCs有著密切關系［19］。Hofman等［20］研究發現，在轉移性NSCLC中，化療前檢測出CTCs數量多的患者，其PFS及OS均明顯縮短。Hou等［21］研究發現，化療前、后CTCs的變化對患者的PFS 及OS有較強預測作用。Hofman等［22］進一步研究表明，CTCs可以作為可手術的NSCLC預后評價指標，說明可手術治療的NSCLC預后與術前CTCs計數相關，提示術前檢測患者CTCs對預測預后有著一定的價值。Rolle等［23］發現，已手術治療的肺癌患者，其預后也與術后CTCs數量變化相關，術后CTCs增加的患者復發風險明顯增高。對肺癌患者來說，CTCs數目的增加，提示腫瘤的復發進展或轉移風的上升，預示患者的預后較差。

3.5CTCs與NSCLC分子靶向治療隨著個體化治療研究深入，肺癌治療進入了基于腫瘤分子標志物指導下的化療、靶向綜合治療的新時代。表皮生長因子受體（EGFR）成為目前研究的熱點，但是部分患者不易獲得組織標本，從而使EGFR檢測受到一定的限制。CTCs的存在，為這些患者行相關基因檢測，提供了另外一條可能途徑，就是從這些患者的CTCs中提取相關基因，來檢測是否存在基因突變，再根據基因突變的情況，來指導進一步的治療。Kimura等［24］使用擴增阻滯突變系統方法提取患者血清中的DNA，并檢測了EGFR突變情況，提示與原發組織中EGFR突變之間存在較高的一致性（72.7%），說明血清DNA檢測EGFR突變具有可操作性，為進一步使用CTCs檢測基因突變成為可能。Maheswaran等［25］選擇了12例存在EGFR突變的NSCLC，檢測CTCs所攜帶的EGFR情況，結果顯示有11例同樣存在EGFR基因突變，與組織中EGFR突變有著很高的一致性。研究表明，在靶向治療的過程中，基因的突變或者表達可能發生改變產生繼發性耐藥，例如對酪氨酸激酶抑制劑（TKIs）有良好治療反應的NSCLC患者，在治療開始后的10～12個月內，對TKIs制劑（如吉非替尼）不再有效，其中EGFR20號外顯子突變（T790M）的存在是EGFR-TKIs耐藥主要原因之一［25］。Sequist等［26］研究發現，在對EGFR-TKIs耐藥的患者中，同樣存在CTCs的T790M突變，提示CTCs的基因突變與原發組織存在高度的一致性，并證明了T790M突變明顯降低了患者PFS。Gasch等［27］同樣證實在CTCs表面存在EGFR突變，并進一步證實CTCs標記的EGFR與患者原發病灶之間存在異質性。這說明了EGFR-TKIs制劑對不同患者存在療效差異的原因，也是表面分子靶向治療存在原發耐藥的原因之一。Pailler等［28］選取了18例存在間變性淋巴瘤激酶（ALK）基因重排的NSCLC，研究者提取CTCs 的ALK基因檢測，顯示ALK基因重排同樣存在，從而可以指導ALK抑制劑克唑替尼在NSCLC的治療。Ilie等［29］對NSCLC中ALK基因重排的研究中，也得到了同樣的結論。隨著基因個體治療研究的不斷深入，肺癌中越來越多的靶基因被發現，它們為肺癌的分子靶向治療提供更加廣闊的前景，同樣，這些生物標記也可以從肺癌CTCs提取出來，來對個體化治療進行優化。研究表明，核苷酸切除修復交叉互補組1（ERCC1）在NSCLC中存在，其表達水平高的患者，對鉑類藥物化療反應差，表達水平低的患者，含鉑方案化療療效較好；進一步研究提示，ERCC1的表達水平與患者的生存呈負相關［30］。Das等［31］檢測了17例轉移性NSCLC患者CTCs的ERCC1的表達水平，數據同樣顯示ERCCl表達水平與患者的PFS呈現負相關。ERCC1無表達的患者的PFS明顯長于高表達的患者（172、226 d，P＜0.05）。

CTCs的檢測可為腫瘤的個體化治療提供最有效、最實時的依據。對腫瘤治療療效的提高提供有力的支持。

4　展　望

隨著人們對CTCs的認識不斷加深及檢測技術的持續進步，CTCs重要性及其價值越來越被人們認可。CTCs檢測具有無創性及可重復性的優點，CTCs檢測在肺癌轉移的早期診斷及評估預后方面具有重要意義。其可以作為目前影像學檢查的有益補充，以評估治療療效，并可以指導分子靶向藥物的應用，進一步促進個體化治療的發展。目前CTCs檢測方法處于飛速發展階段，但仍有以下問題需要解決：（1）需進一步改進檢測技術及設備，使其CTCs檢測特異性及敏感性有待進一步提高；（2）進一步從分子水平上深化肺癌及其他腫瘤發生、發展、轉移和復發機制，促進CTCs在臨床上的應用；（3）需開發簡單有效的檢測設備，降低檢測相關費用。

總之，隨著人們對CTCs研究的持續發展，必將使CTCs更加利于NSCLC的診療。期待CTCs的檢測在不久的將來給廣大NSCLC患者帶來更大的福音。

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10.3969/j.issn.1009-5519.2016.05.026

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（2015-12-23）