乳腺癌干細胞調控機制的研究進展

蔣雪梅，頓耀艷綜述，肖長義審校

（三峽大學醫學院，湖北宜昌443002）

乳腺癌干細胞調控機制的研究進展

蔣雪梅，頓耀艷綜述，肖長義審校

（三峽大學醫學院，湖北宜昌443002）

乳腺腫瘤；干細胞；微RNAs；綜述

白血病干細胞在1994年被Lapidot等［1］發現后癌癥干細胞（CSCs）的概念已被接受［1］，CSCs啟動腫瘤的形成。據報道CSCs存在于多種腫瘤中，包括乳腺癌、肺癌、白血病、膠質瘤、結腸癌、肝癌等；同時，一些分子標志已經被使用于分離整個癌細胞群，例如乙醛脫氫酶（ALDH）針對乳腺癌干細胞（BCSCs）、CD90和CD133針對肝癌干細胞、ABCB5和CD271+針對膠質瘤癌干細胞、CD133針對腦腫瘤干細胞。CSCs是異源的，例如BCSCs和結腸癌干細胞包括至少2種不同的分子標記類型鑒別CSCs［2］。從遺傳學角度來說，BCR-ABL1淋巴細胞白血病包含多種明顯的白血病干細胞亞克隆［3］。

目前，已經揭示一些信號途徑在調節CSCs的自我更新和分化中起了關鍵作用。Wnt信號對CSCs自我更新是重要的，例如，整體存活更差的低分化的基底乳腺癌Wnt/β連環蛋白信號被激活［4］。Wnt信號的基本活化作用被腫瘤抑制劑APC的突變導致BCSCs的擴增。Her2+乳腺癌Wnt抑制信號抑制腫瘤的啟動和轉移［5-6］。Notch信號在調節CSCs是重要的，例如已有報道從肺腺癌和乳腺癌中Notch-GFP系統被用于分離CSCs，GFP+癌細胞能分化成GFP-癌細胞，并且有很強的腫瘤啟動能力［7-8］。Notch信號誘導脫乙酰基酶（SIRT2）具有脫乙酰基和激活ALDH1A1及增加BCSCs的作用［9］。除這些信號途徑外，表皮生長因子-β（TGF-β）、IL-6/JAK/STAT3、核因子-κB（NF-κB）信號和其他信號途徑在調節CSCs上起關鍵作用，并且其在調節上有時互相干擾。

1　BCSCs

2003年Clarke等分離了假定的BCSCs作為ESA+CD44+CD24-細胞群。幾乎很少的ESA+CD44+CD24細胞在體外能夠產生腫瘤。另外，繼發性腫瘤與原始腫瘤表型類似（形態學和ESA/CD44/CD24表達模式，腫瘤源性的ESA+CD44+CD24-腫瘤細胞至少能被連續在體外通過4條通道。有研究使用了幾種方法適應干細胞的研究來分離或研究BCSCs，包括SP測定、Aldefluor測定和球形測定，SP測定是根據干細胞的能力排除DNA的測定。例如，通過膜轉運者Hoechst 33342，SP測定已經顯示在乳腺癌細胞株內包含最易生腫瘤的群并且在體外被移植。Aldefluor測定代表一組酶催化的氧化。在惡性乳腺上皮，在體內外具有高度ALDH的活性與最大的自我更新和分化能力有關。ALDH免疫染色陽性與乳腺癌有較差的預后相關性［9］。當生長在體外非黏附的類似球體BCSCs也被濃集。2個腫瘤啟動群（ALDH+細胞和ESA+CD44+CD24-細胞）僅僅顯示有限的重疊（Box1）。通過其他組乳腺癌包含腫瘤起始細胞顯示不同細胞的表面標記也被顯示相似的發現［10］。盡管BCSCs的異質性，這些細胞通常與治療抵抗和腫瘤relapse相關，在癌癥治療中有2個主要障礙。因此，理解CSCs的生物學將幫助靶向CSCs的新治療方法的發展，以利于更有效的治療和癌癥的最終治愈。

BCSCs被microRNAs（miRNAs）調控，miRNA通過mRNA調節靶向。miRNA的生物機制已經被Kim等［11］詳細總結。有研究已顯示，miRNAs在實體瘤和白血病中調節細胞增生、侵襲、轉移和腫瘤的血管形成。miR-29通過靶向Mcl-1和Bcl-2促進肝細胞、癌細胞的凋亡［12］。在乳腺癌miR-10b通過靶向RHOC啟動腫瘤的侵襲和轉移。miRNA測定分析顯示了let-7a在乳腺分化的癌細胞被下調。一些蛋白甲基轉移酶不僅催化組蛋白的甲基化，還催化非組蛋白的蛋白質。例如，SET7/9催化組蛋白3的單甲基化，也催化K135的Lin28A的甲基化來促進Lin28在核內的聚集，并且增加穩定性和Lin28的prilet-7結合能力［13］。miR-200家族包括miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-141和miR-429腫瘤抑制劑。通過靶向ZEB1和ZEB2而抑制EMT。通過靶向BMI1 miR-200c抑制BCSCs。miR-200b通過靶向E-連環蛋白SUZ12、H3K27me3和其他基因而抑制BCSCs［14］。近年來，Pandolfi等發現miR-22通過靶向TET1、TET2及TET3促進EMT，腫瘤浸潤和正常BCSCs的轉移；miR-22的過度表達提高了一些多能性和EMT-相關基因的表達，例如BMI1、ZEB1及ZEB2。TET1、TET2及TET3能抑制miR-200啟動子的脫甲基化。因此，miR-22通過抑制miR-200的表達促進BCSCs，表明DNA脫甲基酶能調節BCSCs。miR-93在來自于乳腺癌不同亞型的BCSCs起不同作用。在乳腺癌細胞基底型中，例如SUM159通過靶向AKT3、SOX4和STAT3，miR-93抑制CSCs和啟動間充質-上皮的轉化（MET）。然而，在窗型乳腺癌中如人乳腺癌細胞（MCF-7）能促進BCSCs，表明miR-93調節BCSCs的雙重作用是依賴細胞分化的狀態，但該機制還在被闡明［15］。除了BCSCs外，miRNAs的調節異常在其他類型的CSCs也被發現。在結腸癌干細胞里，miR-34a的功能主要依賴其表達水平；高miR-34a表達抑制Notch信號途徑和促進CSCs的分化；低miR-34a的表達促進Notch信號途徑和保持CSCs表型。越來越多的研究顯示，miRNAs通過被鏈接到治療載體，例如，納米粒子能潛在地被用于治療腫瘤。

2　lncRNAs在調節乳腺癌和CSCs的調節發揮重要作用

長非編碼RNAs（lncRNAs）是長度大于200 nt的非編碼RNA。大量lncRNAs已被發現，但只有少數lncRNAs現在已被充分研究。最近，lncRNAs已在許多癌癥中被研究，例如，lncRNA-ATB在肝細胞癌、乳腺癌和結腸癌里通過TGF-β激活誘發EMT［16］。其不僅作為競爭內源性RNA（ceRNA）競爭性的結合miR-200家族上調其目標和誘發EMT，但是還結合IL-11 mRNA，增加IL-11的穩定性和誘導IL-11的自分泌來激活STAT3通路，這個通路在調節BCSCs發揮至關重要的作用。lncRNA-ATB可能通過調節miR-200家族和STAT3來調控BCSCs。

BCAR4可以誘導GLI目標基因的激活和促進乳腺癌的轉移，特別是三陰性乳腺癌。GLI的靶基因在BCSCs發揮關鍵作用。這些表明BCAR4可調節BCSCs，并通過進一步的研究被證明。此外，lncRNA lncTCF7調控肝細胞癌干細胞自我更新證明了通過體外腫瘤球形形成能力和體內腫瘤啟動頻率。lncTCF7重新募集SWI/SNF復合體結合TCF7啟動子和激活TCF7的表達，TCF7激活Wnt途徑來擴充肝細胞癌干細胞［17］。lncRNA-ROR是一個細胞重新編程和多能性的調制器。對于乳腺癌，lncRNA-ROR誘導EMT和促進其轉移，lncRNA-ROR過度表達會增加CD24-CD44+細胞群百分比和微球體數量。進一步的分析表明，其可以作為靶向EMT誘導者ZEB2和阻斷ZEB2退化來促進EMT［18］。隨著lncRNAs研究進展，越來越多的lncRNAs將在調節CSCs被得到證實。lncRNAs代表一種新型的CSCs調節器，其通過調節miRNAs、mRNAs和其他的lncRNAs。lncRNAs的研究將提高CSCs新型分子調節的理解，lncRNAs可以針對新的治療方法和預后因素作為目標功能。

3　組蛋白調節器

組蛋白H2A、H2B、H3和H4被組蛋白修飾酶，包括組蛋白乙酰轉移酶、組蛋白甲基轉移酶和組蛋白去乙酰酶修改。通過調節染色質的狀態在調節轉錄中發揮作用，其也彼此串道。H3K4脫甲基酶Jarid1B/KDM5B在乳腺癌被放大和過度表達來促進細胞增殖。RNA-seq和ChIP-seq分析揭示了Jarid1的結合位點是顯著富集在啟動子和增強基因腔型的比基底型的高，表明其是一個腔型聯系的啟動致癌基因［19］。共激活劑相關的精氨酸甲基轉移酶1（CARM1）甲醇化物BAF155在R1064。BAF155甲基化在體內和體外促進乳腺癌的入侵和轉移。染色質免疫沉淀反應（ChIP）分析表明，CARM1控制c-myc通路中的基因表達［20］。

3.1NYD1/KDM2BH3K36me1/2和H3K4me3脫甲基酶NYD1/KDM2B在ES和iPS中起一個重要作用。其被多能性因素OCT4和SOX直接調控，且與Ploycomb抑制性復合物1（PRC1）的核心單元相互作用，如Ring1B和征募PRC1到控制細胞分化的啟動子基因的CpG島，導致分化基因的抑制。這也表明KDM2B可以作為Polycomb組抑制元素（PRE）來抑制分化基因的表達［21］。KDM2B是一種致癌基因，不僅促進乳腺癌還維持BCSCs。KDM2B結合的部位編碼miR-200家族，miR-101、miR-181及miR-203。SUZ12、EZH2、RING1B、BMI1是這些miRNA的直接目標，并且KDM2B通過抑制這些miRNA抑制BCSCs和上調PcG蛋白的核心亞單元［22］。

3.2EZH2和SUZ12EZH2和SUZ12屬于PRC2。EZH2是組蛋白甲基轉移酶并催化H3K27me3、SUZ12刺激EZH2的活性。EZH2在胚胎干細胞、成體干細胞和癌癥中起關鍵作用。例如，在乳腺EZH2維持腔型祖細胞的自我更新［23］。EZH2也是一個致癌基因且在pRB-E2F通路的下游。EZH2可以作為癌癥早期診斷的分子標記，并且EZH2在正常乳腺上皮細胞超表達增加了患癌癥的風險。此外，EZH2在乳腺癌被上調，高水平的EZH2與侵襲性的乳腺癌相關。在臨床樣本中，EZH2的表達和Notch1呈正相關。EZH2降解抑制來自三陰性乳腺癌的異種移植的出現和增長，并且當EZH2過表達相反的表型也出現。EZH2過度表達激活Notch1信號活動來促進BCSCs的自我更新。進一步分析表明，EZH2調節Notch轉錄活動依賴直接結合Notch1啟動子而非組蛋白甲基轉移酶的活性。在惡性膠質瘤干細胞，EZH2激活STAT3信號，促進致腫瘤性［24］。Jung等［25］發現PAF（PCNA-相關因子）與β-連環蛋白相互作用來募集EZH2和形成轉錄復合物，該復合物特別反式激活Wnt信號的目標基因，暗示EZH2通過激活Wnt通路擴充BCSCs，這表明EZH2可能是中心蛋白質，并由幾個關鍵的信號通路調節CSCs。進一步的研究還需要揭示調控機制。

SUZ12促進Hox基因的沉默、細胞增殖和胚胎發生。在一些癌癥里SUZ12經常被發現突變，例如，SUZ12突變引起周圍神經鞘瘤的惡性轉換［26］。SUZ12也是一個直接目標miR-200b，其是BCSCs抑制劑。miR-200b部分通過SUZ12抑制BCSCs，但SUZ12調節BCSCs的分子機制還有待闡明。

3.3BMI1BMI1-PRC1是規范的組成部分，一個E3泛素連接酶和壓縮的多聚核小體的輔助因子。越來越多的證據表明，BMI1在調節正常的和CSCs的自我更新方面起著重要作用。BMI1是腸道干細胞的標志，并且BMI1抑制劑已被發現抑制結直腸癌干細胞［27］。BMI1在BCSCs的自我更新中起著關鍵作用。Neven等［28］報道了lncRNA FAL1在某些類型的癌癥，包括乳腺癌里過度表達，且其和BMI1-PRC1復合體相互作用，通過阻斷其蛋白酶體的降解來增強其穩定性，且影響了H2AK119的泛素化水平表觀遺傳抑制基因的表達，例如，CDKN1A［28］。PRC1通過PREs結合目標位點，且PREs也許是ncRNAs或蛋白質，例如，Jarid2、KDM2B和HOTAIR［29］。這些表明BMI1能與ncRNAs互相干擾。

4　小結

ncRNA的作用和組蛋白調節器調節BCSCs。越來越多的非編碼RNA已經被發現調節CSCs，并且組蛋白調節器的新功能和機制也變得越來越清晰。miRNAs是短序列ncRNAs，并且其容易與納米向量共價結合。當miRNAs或特定的miRNAs反義核苷酸能被納米向量傳遞給腫瘤細胞，腫瘤細胞將被nanovectors根除。所以，藥物的納米載體發展是很重要的。lncRNAs是CSCs新發現的監管者，并且調節機制通過調查越來越多的lncRNAs變得越來越清晰。lncRNAs也可以作為治療目標起作用。例如，抑制lncRNA具有鎖核酸的BCAR4（LNA），基于反義的寡核苷酸抑制乳腺癌的轉移［30］。迄今為止，CSCs不能像胚胎干細胞一樣在體外未分化的狀態被培養，具有特定標記的流式細胞術是分離CSCs的主要方法。一些重要的技術用于研究機制，例如，ChIP和ChIP-seq需要一個更大的細胞數量，其不適合CSCs的研究。但是新技術單細胞RNA測序等和ChIP-seq 500細胞［31］，將為CSCs的研究帶來新的希望。例如，表觀遺傳調節蛋白質在CSCs的調節中發揮重要作用，但監管調節機制仍未深入研究是由于CSCs細胞量少，單細胞RNA-序列和500細胞ChIP-seq將最終會解決該問題。單細胞RNA-序列的承諾和挑戰已被評估［32］。信號通路之間的相互作用，ncRNAs和組蛋白調節器在調節CSCs起著至關重要的作用。信號通路網絡的完全理解，ncRNAs和組蛋白調節器將有利于腫瘤的治療。

［1］Lapidot T，Sirard C，Vormoor J，et al.Acell initiating human acute myeloid leukaemia after transplantationinto SCIDmice［J］.Nature，1994，367（6464）：645-648.

［2］Liu S，Cong Y，Wang D，et al.Breast cancer stem cells transition between epithelialandmesenchymalstatesreflectiveoftheirnormalcounterparts［J］. Stem Cell Reports，2014，2（1）：78-91.

［3］Notta F，Mullighan CG，Wang JC，et al.Evolution of human BCR-ABL1 lymphoblastic leukaemia-initiating cells［J］.Nature，2011，469（7330）：362-367.

［4］Khramtsov AI，Khramtsova GF，Tretiakova M，et al.Wnt/beta-catenin pathway activation is enriched in basal-like breast cancers and predicts poor outcome［J］.Am J Pathol，2010，176（6）：2911-2920.

［5］Monteiro J，Gaspar C，Richer W，et al.Cancer stemness in Wnt-driven mammary tumorigenesis［J］.Carcinogenesis，2014，35（1）：2-13.

［6］Schade B，Lesurf R，Sanguin-Gendreau V，et al.β-Catenin signaling is a critical event in ErbB2-mediated mammary tumor progression［J］.Cancer Res，2013，73（14）：4474-4487.

［7］D′Angelo RC，Ouzounova M，Davis A，et al.Notch reporter activity in breastcancercelllines identifies a subset of cells with stem cell activity［J］. Mol Cancer Ther，2015，14（3）：779-787.

［8］Hassan KA，Wang L，Korkaya H，et al.Notch pathway activity identifies cells with cancer stem cell-like properties and correlates with worse survivalinlungadenocarcinoma［J］.ClinCancerRes，2013，19（8）：1972-1980.

［9］Zhao D，Mo Y，Li MT，et al.NOTCH-induced aldehyde dehydrogenase 1A1 deacetylation promotes breast cancer stem cells［J］.J Clin Invest，2014，124（12）：5453-5465.

［10］Wright MH，Robles AI，Herschkowitz JI，et al.Molecular analysis reveals heterogeneity of mouse mammary tumors conditionally mutant for Brcal［J］. Mol Cancer，2008，7：29.

［11］Kim VN，Han J，Siomi MC.Biogenesis of small RNAs in animals［J］.Nat Rev Mol Cell Biol，2009，10（2）：126-139.

［12］Xiong YJ，Fang JH，Yun JP，et al.Effects of microRNA-29 on apoptosis，tumorigenicity，and prognosis of hepatocellular carcinoma［J］.Hepatology，2010，51（3）：836-845.

［13］Kim SK，Lee H，Han K，et al.SET7/9 methylation of the pluripotency factor LIN28A is a nucleolar localization mechanism that blocks let-7 biogenesis in human ESCs［J］.Cell Stem Cell，2014，15（6）：735-749.

［14］Iliopoulos D，Lindahl-Allen M，Polytarchou C，et al.Loss of miR-200 inhibition of Suz12 leads to polycomb-mediated repression required for the formation and maintenance of cancer stem cells［J］.Mol Cell，2010，39（5）：761-772.

［15］Liu S，Patel SH，Ginestier C，et al.MicroRNA93 regulates proliferation and differentiation of normal and malignant breast stem cells［J］.PLoS One，2012，8（6）：e1002751.

［16］Yuan JH，Yang F，Wang F，et al.A long noncoding RNA activated by TGF-beta promotes the invasion-metastasis cascade in hepatocellular carcinoma［J］.Cancer Cell，2014，25（5）：666-681.

［17］Wang Y，He L，Du Y，et al.The long noncoding RNA lncTCF7 promotes selfrenewal of human liver cancer stem cells through activation of Wnt signaling［J］.Cell Stem Cell，2015，16（4）：413-425.

［18］Hou P，Zhao Y，Li Z，et al.LincRNA-ROR induces epithelial-to-mesenchymal transition and contributes to breast cancer tumorigenesis and metastasis［J］.Cell Death Dis，2014，5：e1287.

［19］Yamamoto S，Wu ZH，Russnes HG，et al.JARID1B is a luminal lineagedriving oncogene in breast cancer［J］.Cancer Cell，2014，25（6）：762-777.

［20］Wang L，Zhao Z，Meyer MB，et al.CARM1 methylates chromatin remodeling factor BAF155 to enhance tumor progression and metastasis［J］. Cancer Cell，2014，25（1）：21-36.

［21］He J，Shen L，Wan M，et al.Kdm2b maintains murine embryonic stem cell status by recruiting PRC1 complex to CpG islands of developmental genes［J］.Nat Cell Biol，2013，15（4）：373-384.

［22］Kottakis F，Foltopoulou P，Sanidas I，et al.NDY1/KDM2B functions as a master regulator of polycomb complexes and controls self-renewal of breast cancer stem cells［J］.Cancer Res，2014，74（14）：3935-3946.

［23］Michalak EM，Nacerddine K，Pietersen A，et al.Polycomb group gene Ezh2 regulates mammary gland morphogenesis and maintains the luminal progenitor pool［J］.Stem Cells，2013，31（9）：1910-1920.

［24］Kim E，Kim M，Woo DH，et al.Phosphorylation of EZH2 activates STAT3 signaling via STAT3 methylation and promotes tumorigenicity of glioblastoma stem-like cells［J］.Cancer Cell，2013，23（6）：839-852.

［25］Jung HY，Jun S，Lee M，et al.PAF and EZH2 induce Wnt/beta-catenin signaling hyperactivation［J］.Mol Cell，2013，52（2）：193-205.

［26］Zhang M，Wang Y，Jones S，et al.Somatic mutations of SUZ12 in malignant peripheral nerve sheath tumors［J］.Nat Genet，2014，46（11）：1170-1172.

［27］Kreso A，van Galen P，Pedley NM，et al.Self-renewal as a therapeutic target in human colorectal cancer［J］.Nat Med，2014，20（1）：29-36.

［28］Neven E，De Schutter TM，Dams G，et al.A magnesium based phosphatebinder reduces vascular calcification without affecting bone in chronic renal failure rats［J］.PLoS One，2014，9（9）：e107067.

［29］Schwartz YB，Pirrotta V.A new world of Polycombs：unexpected partnerships and emerging functions［J］.Nat Rev Genet，2013，14（12）：853-864.［30］Xing Z，Lin A，Li C，et al.lncRNA directs cooperative epigenetic regulationdownstreamofchemokinesignals［J］.Cell，2014，159（5）：1110-1125.

［31］Lara-Astiaso D，Weiner A，Lorenzo-Vivas E，et al.Immunogenetics.Chromatin state dynamics during blood formation［J］.Science，2014，345（6199）：943-949.

［32］Stegle O，Teichmann SA，Marioni JC.Computational and analytical challenges in single-cell transcriptomics［J］.Nat Rev Genet，2015，16（3）：133-145.

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.19.019

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1009-5519（2016）19-2994-04

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