草分枝桿菌及其在獸醫(yī)領(lǐng)域的應(yīng)用研究進(jìn)展

王小柱

（遼寧省畜產(chǎn)品安全監(jiān)察所，遼寧 沈陽 110003）

草分枝桿菌及其在獸醫(yī)領(lǐng)域的應(yīng)用研究進(jìn)展

王小柱

（遼寧省畜產(chǎn)品安全監(jiān)察所，遼寧 沈陽 110003）

草分枝桿菌具有很強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)作用，是一種寶貴的微生態(tài)資源，在人醫(yī)領(lǐng)域已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用，但獸醫(yī)臨床應(yīng)用還處在初步探索階段。本文詳細(xì)描述了草分枝桿菌的生物學(xué)和免疫學(xué)特性，并對(duì)其在獸醫(yī)領(lǐng)域的應(yīng)用進(jìn)行了初步概述。

草分枝桿菌；獸醫(yī)；免疫；應(yīng)用

草分枝桿菌（Mycobacterium phlei，M.phlei）是一種在土壤、植物和飲水中廣泛分布的耐酸桿菌，最早由德國人Lehm ann和N eum ann從干牧草中分離純化[1]。由于它對(duì)人和動(dòng)物幾乎無致病性，滅活后其細(xì)胞壁等成分具有免疫刺激作用，目前，在臨床上多用作免疫增強(qiáng)劑，是一種寶貴的微生態(tài)制劑資源[2]。

在人醫(yī)領(lǐng)域，草分枝桿菌制劑已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用，其藥理、毒理學(xué)研究也較為深入[3]。然而，在畜牧獸醫(yī)領(lǐng)域，草分枝桿菌的研究和應(yīng)用才剛起步。本文就草分枝桿菌的特性及在獸醫(yī)領(lǐng)域的應(yīng)用進(jìn)行了綜述。

1 生物學(xué)性質(zhì)

草分枝桿菌屬于放線菌綱放線菌目分枝桿菌科，是一種典型的非致病性腐生菌[1]。菌體多呈短桿狀，無鞭毛、無芽孢，長約1.0～2.0 μm，胞體周圍包裹著分枝菌酸等成分形成的細(xì)胞壁，具有抗酸性，革蘭染色不易著色，抗酸染色不規(guī)則。經(jīng)加溫或延長時(shí)間著色后能抵抗3%鹽酸酒精的脫色作用[4]。

培養(yǎng)特性上，在凝縮的卵培養(yǎng)基或L-J培養(yǎng)基上生長快速，培養(yǎng)2～5 d后產(chǎn)生粗燥的橙黃色菌落。在綿羊血瓊脂培養(yǎng)基中，菌落扁平光滑，呈現(xiàn)深黃色[1]。不產(chǎn)生內(nèi)、外毒素。

不同菌株基因組長度有所差異，其中常見的RIVM 601174株全長約5 681.954 kb，含有5 435個(gè)編碼序列（CDS），4套rRN A操縱子和50個(gè)tRN A編碼基因。其GC含量高達(dá)69.24%，是分枝桿菌屬中Tm值最高的菌種之一[5]。

2 免疫學(xué)性質(zhì)

草分枝桿菌細(xì)胞壁富含脂質(zhì)，主要成分是分枝菌酸。菌體干粉中主要為粗蛋白和糖類。滅活處理后，細(xì)胞壁活性成分胞壁酰二肽（M DP）、草分枝桿菌多糖（M PS）及CpG免疫調(diào)節(jié)序列等能夠刺激相應(yīng)免疫細(xì)胞產(chǎn)生免疫應(yīng)答，進(jìn)而調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能，增強(qiáng)機(jī)體免疫力[6]。

2.1 對(duì)體液免疫的作用 草分枝桿菌制劑可以增強(qiáng)Th細(xì)胞活性，促使Th細(xì)胞分泌B細(xì)胞生長因子（BCGF）以及B細(xì)胞分化因子（BCDF），從而刺激B細(xì)胞進(jìn)入增殖、分化階段，最終促進(jìn)特異性抗體形成。臨床藥理作用表明，使用本品后血清IgG、IgM滴度增高[7]。

陳仁等在小鼠試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)分枝桿菌多糖制劑可顯著增強(qiáng)小鼠脾細(xì)胞產(chǎn)生抗體的能力，當(dāng)對(duì)每只小鼠每次注射10～0.01μg分枝桿菌多糖（M ps）的各試驗(yàn)組與對(duì)照組比較均有極顯著性差異（P＜0.001）[8]。

2.2 對(duì)細(xì)胞免疫的作用 草分枝桿菌制劑能顯著增強(qiáng)特異性細(xì)胞免疫，促進(jìn)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化、增殖和白細(xì)胞介素2（IL-2）、白細(xì)胞介素4（IL-4）、腫瘤壞死因子（TN F）、γ-干擾素（IFN-γ）、促有絲分裂因子（mm F）、巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子（M IF）、巨噬細(xì)胞凝集因子（M AF）、巨噬細(xì)胞趨化因子（M CF）等細(xì)胞因子的產(chǎn)生，能夠顯著增強(qiáng)單核-巨噬細(xì)胞、自然殺傷（N K）細(xì)胞的活性。將草分枝桿菌按0.57 μg/次劑量施加小鼠，共3次，臨床動(dòng)物藥理實(shí)驗(yàn)證明，TLR4的表達(dá)和CD4+，CD25+，Treg可受調(diào)節(jié)[6]。此外，El l ouz等還發(fā)現(xiàn)M DP是細(xì)胞壁肽聚糖最小的免疫活性單位，單核-巨噬細(xì)胞可通過M APK和N F-κB途徑受其調(diào)控產(chǎn)生IL-1、IL-6和TN F-α等細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子又可以進(jìn)一步活化免疫系統(tǒng)[6]。

3 在獸醫(yī)領(lǐng)域的應(yīng)用

3.1 抗腫瘤作用 草分枝桿菌最初主要用于惡性腫瘤、呼吸道感染等的治療，其細(xì)胞壁中熱穩(wěn)定和水溶性的亞組分具有主要的抗瘤活性[6]。其制劑可明顯增強(qiáng)宿主抗腫瘤免疫應(yīng)答，增加宿主對(duì)細(xì)胞毒化學(xué)治療的耐受力，調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能，提高機(jī)體抗腫瘤作用，減少腫瘤復(fù)發(fā)。Fi l i on等[9]發(fā)現(xiàn)草分枝桿菌細(xì)胞壁可誘導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞的凋亡。

目前，在產(chǎn)品制劑研發(fā)方面，德國的Sanum-Kahl beck公司研發(fā)的烏體林斯產(chǎn)品仍處于同類領(lǐng)先地位，廣泛用于人醫(yī)和獸醫(yī)的臨床治療上[10]。

3.2 抗寄生蟲作用 Tewari等[11]將滅活的草分枝桿菌全菌制劑以10 m g/只的劑量免疫感染球蟲的肉雞，7 d后，免疫組較對(duì)照組盲腸病變減少，生長性能有效提高，血清和膽汁中的IgA水平也顯著提高。同時(shí)，還可以治療感染巴貝斯蟲的小牛[12]。

3.3 非特異性抗感染作用 草分枝桿菌制劑能增強(qiáng)正常和免疫系統(tǒng)缺陷的動(dòng)物對(duì)多種病原體如肺炎桿菌、大腸桿菌、綠膿桿菌和白色念珠菌等感染的非特異性抵抗力，并與抗生素具有協(xié)同作用。劉安石等[13]通過構(gòu)造豬支原體和放線桿菌模型證實(shí)草分枝桿菌協(xié)同泰妙菌素、磷酸替米考星治療在控制臨床癥狀的同時(shí)，增重效果最好，治愈率明顯高于對(duì)照組。草分枝桿菌基于同結(jié)核菌的生物親緣性，通過特殊的物質(zhì)交換，可持久地介入宿主的免疫過程，不斷調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫能力（尤其是細(xì)胞免疫），從而表現(xiàn)出殺菌、清除體內(nèi)病原菌、增強(qiáng)抵抗力等免疫效應(yīng)，達(dá)到治療目的。

3.4 免疫調(diào)節(jié)劑作用 Sreekumar等[14]將滅活草分枝桿菌作為疫苗調(diào)節(jié)劑先給雞群灌服，而后灌服新城疫（F株）活疫苗。結(jié)果顯示，雞群H I抗體較對(duì)照組并未出現(xiàn)大的變化，但顯著影響了細(xì)胞介導(dǎo)的免疫作用（CM I）。Tew ari等[12]把滅活的巴貝斯蟲做抗原，分別用完全弗氏佐劑（FCA）和滅活草分枝桿菌做為免疫調(diào)節(jié)劑接種小牛，結(jié)果表明，滅活草分枝桿菌具有良好的免疫調(diào)節(jié)作用。中國農(nóng)科院選用草分枝桿菌、短小棒狀桿菌、鹽酸氣芥、新城疫弱毒苗組成復(fù)合免疫增強(qiáng)劑，在幼畜腹瀉的預(yù)防中具有顯著而獨(dú)特的作用，可以明顯降低發(fā)病率和死亡率[15]。劉安石等[16]在豬群免疫豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）疫苗后，飼料中添加0.2%以上的草分枝桿菌，較對(duì)照組可有效提高抗體的滴度和持續(xù)時(shí)間，增強(qiáng)疫苗的保護(hù)效果。

3.5 促生長作用和菌群調(diào)節(jié)作用 涂威等[7]在斷奶仔豬日糧中添加0.1%～0.4%的滅活草分枝桿菌，30 d后測定體重及盲腸內(nèi)容物菌群結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)飼喂組可降低腹瀉率，大腸桿菌數(shù)量大幅減少，乳酸桿菌數(shù)量上升，且呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性。

4 應(yīng)用前景與展望

近年來，隨著畜牧業(yè)的發(fā)展和人們對(duì)畜產(chǎn)品安全的日益重視，畜禽疾病的防治也不再單依賴抗生素和疫苗。隨之而來的諸如微生態(tài)制劑、多糖類、多肽類等動(dòng)保產(chǎn)品適應(yīng)市場需求而發(fā)展迅速[17]。

目前，在實(shí)驗(yàn)室研究上，人醫(yī)對(duì)草分枝桿菌的研究相對(duì)深入。對(duì)其細(xì)胞壁的免疫活性成分進(jìn)行了深入探究。發(fā)現(xiàn)MDP、MPS 和CpG 免疫調(diào)節(jié)序列是其具有免疫調(diào)節(jié)功能的主要成分。在分子和基因水平，Abdallah AM測定了草分枝桿菌（RIVM601174株）全基因組序列。Ellouz 等探討了草分枝桿菌在信號(hào)通路中所起的調(diào)節(jié)作用。在獸醫(yī)臨床應(yīng)用上，SreekumarE 和Tewari AK 做了很多早期探索。先后嘗試驗(yàn)證了草分枝桿菌對(duì)小鼠的抗腫瘤作用、對(duì)雞的抗球蟲作用、對(duì)牛的巴貝斯蟲的治療作用等，讓人們認(rèn)識(shí)到了草分枝桿菌在畜牧獸醫(yī)領(lǐng)域的應(yīng)用前景。近年來，國內(nèi)一些研究者也開始關(guān)注草分枝桿菌在畜牧獸醫(yī)領(lǐng)域的研究和應(yīng)用。劉安石等證實(shí)了草分枝桿菌對(duì)豬衣原體、放線菌、呼吸與繁殖綜合征等疾病的有效治療和調(diào)節(jié)作用。此外，草分枝桿菌具備調(diào)節(jié)動(dòng)物腸道微生態(tài)、促生長和治療非特異性抗感染等作用，是一種寶貴的天然藥物和微生態(tài)制劑資源，符合人們關(guān)注畜產(chǎn)品安全，減少抗生素使用的理念。

在產(chǎn)品生產(chǎn)方面，由于草分枝桿菌分許多亞種，不同亞種之間存有功能上的差異，篩選和純化具有臨床醫(yī)用功能的菌株是目前研究的主攻方向。然而，在畜牧獸醫(yī)臨床上，尚未見到曹分枝桿菌的衍生產(chǎn)品，好在國內(nèi)畜牧獸醫(yī)領(lǐng)域?qū)ζ溲芯恳呀?jīng)起步，但是目前無論在實(shí)驗(yàn)室研究或是在臨床應(yīng)用方面均顯單薄，相信未來在獸藥、飼料添加劑、動(dòng)保產(chǎn)品等領(lǐng)域草分枝桿菌均有大的發(fā)展空間和光明前景。

[1]布坎南，吉本斯.伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)（第八版）[M]，1984：958.

[2]葉維民.草分枝桿菌口服液的研制及其對(duì)斷奶仔豬的臨床應(yīng)用研究[D]，長沙：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2013，11.

[3]黨麗云，張琦，曹思哲，等.草分枝桿菌疫苗輔助治療耐多藥肺結(jié)核臨床及免疫功能觀察[J].陜西醫(yī)學(xué)雜志，2004（1）：23-25.

[4]龔真莉，陳國棟，劉光遠(yuǎn).結(jié)核分枝桿菌的分子生物學(xué)特點(diǎn)[J]，現(xiàn)代畜牧獸醫(yī)，2007（3）：19-21.

[5]Abdallah AM, Adroub SA, Arnoux M, et al. AComplete genome sequence of Mycobacteriumphlei type strain. RIVM601174[J]. J Bacteriol,2012, 194(12): 2384-2385.

[6]鐘金鳳，方熱軍.滅活草分枝桿菌免疫調(diào)節(jié)研究進(jìn)展[J].免疫學(xué)雜志，2014，11（30）：1011-1015.

[7]涂威.草分枝桿菌制劑在斷奶仔豬日糧中的應(yīng)用效果及其機(jī)理研究[D]，長沙：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2012.6.

[8]陳仁，李郁英，趙文明，等.分枝桿菌多糖（M ps）對(duì)小鼠抗SRbc抗體生成細(xì)胞增強(qiáng)作用的觀察[J]，首都醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，1992，13（1）：8-9.

[9]Filion MC, Lépicier P, Morales A, et al. Mycobacteriumphlei cell wall complex directly inducesapoptosis in human bladder cancer cells[J]. Brit J Cancer, 1999, 79(2): 229-235.

[10]劉福坤，祁曉平，陳徹.新的免疫增強(qiáng)劑-草分枝桿菌的實(shí)驗(yàn)和臨床研究[J].實(shí)用癌癥雜志，2003（2）：126.

[11]Bera AK, Bhattacharya D, Pan D, et al. Effectof heat killed mycobacterium phlei onbody weight gain and management of caecalcoccidiosis in broiler chickens [J]. Res VetSci, 2010, 89(2): 196-169.

[12]Tewari AK, Sharma NN, Rao JR, et al. Effectof Mycobacterium phlei on the development ofimmunity to Babesia bigemina[J]. Vet Parasitol,1996, 62(3/4): 223-230.

[13]劉安石.草分枝桿菌協(xié)同抗生素對(duì)豬支原體和放線桿菌的控制研究[J]，中國畜牧獸醫(yī)文摘，2013，29（2）：213-214.

[14]Sreekumar E, Das SK. Mycobacterium phlei asan oral immunomodulator with newcastle diseasevaccine[J]. Indian J Exp Boil, 2001, 39(10): 989-992.

[15]張顯升，蒲萬霞，但秉成，等.復(fù)合免疫增強(qiáng)劑對(duì)幼畜腹瀉的預(yù)防作用及其機(jī)理的研究[J].中國獸醫(yī)科技，1995（07）：35-37.

[16]劉安石，鐘蘭蘭，楊亞，等.草分枝桿菌對(duì)豬繁殖與呼吸綜合征免疫抗體水平的影響[J].中國獸醫(yī)雜志2013，49（5），42-44.

[17]萬遂如.動(dòng)物微生態(tài)制劑在養(yǎng)豬生產(chǎn)中的應(yīng)用[J]，現(xiàn)代畜牧獸醫(yī)，2012（1）：70-72.

Research progress of Mycobacterium phlei and its application in veterinary field

(The Liaoning Institute of safety supervision for animal products, Liaoning Shenyang 110003)

Mycobacterium phlei，which is a valuable resource of microecological preparation, hasgood immunomodulatory effect. It has been widely used in human medicine, however, in veterinarymedicine fields, it is used initially. In this paper, we summarized the biological properties andimmunological properties of Mycobacterium phlei, and discussed its application in veterinary medicine.

Mycobacterium Phlei; Veterinary medicine; Immune; Application

S828.5

A

1672-9692(2016)03-0055-03

2016-01-17

王小柱（1980-），男，本科，中級(jí)畜牧師，主要研究方向：動(dòng)物飼養(yǎng)及疾病防控，畜產(chǎn)品安全監(jiān)督。