酵母雙雜交技術(shù)篩選杜氏鹽藻cDNA文庫中與S-腺苷高半胱氨酸水解酶相互作用的蛋白*

李慶華,張彥婷,朱立強,柴丹丹,關(guān)方

1)鄭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 鄭州 450001　2)鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗科 鄭州 450014

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酵母雙雜交技術(shù)篩選杜氏鹽藻cDNA文庫中與S-腺苷高半胱氨酸水解酶相互作用的蛋白*

1)鄭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 鄭州 4500012)鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗科 鄭州 450014

關(guān)鍵詞S-腺苷高半胱氨酸水解酶;酵母雙雜交;蛋白相互作用;免疫共沉淀

摘要目的：應(yīng)用酵母雙雜交技術(shù)篩選杜氏鹽藻cDNA文庫中能與S-腺苷高半胱氨酸水解酶(dsSAHH)相互作用的蛋白。方法：將構(gòu)建好的pGBKT7-dsSAHH誘餌載體轉(zhuǎn)化至酵母細胞Y187，與轉(zhuǎn)化有杜氏鹽藻cDNA文庫的酵母細胞AH109雜交，從杜氏鹽藻cDNA文庫中篩選出能與dsSAHH相互作用的蛋白質(zhì)。擴增所得基因片段全長，并在原核內(nèi)表達該融合蛋白。隨后采用Far-western blot、His pull-down及免疫共沉淀方法驗證dsSAHH與目的蛋白在體內(nèi)、外的相互作用。結(jié)果：以dsSAHH為誘餌篩選出3個陽性克隆，擴增得到dsRACK1、dsMetAP1和dseEF1α 3個新基因。His pull-down和免疫共沉淀體內(nèi)外實驗證實dsRACK1能與dsSAHH相互作用。結(jié)論：dsRACK1是dsSAHH的相互作用蛋白。

AbstractAim: To isolate and identify the proteins that interact with S-adenosyhomocystine hydrolase(dsSAHH) in Dunaliella salina(D.salina) cDNA library. Methods: The constructed bait vector pGBKT7-dsSAHH was transformed to yeast cell Y187 and then the Y187 cells hybridized with yeast AH109 cells which contained the cDNA library of D.salina. The proteins that interacted with dsSAHH of D.salina were screened and identified using yeast two-hybrid technology. Then, the full length of screened gene was cloned and the fusion proteins of aimed gene were expressed in E.coli. Finally, the interaction was confirmed by Far-western blot, His pull-down, and co-immunoprecipitation in vitro and in vivo. Results: Three new genes, including dsRACK1, dsMetAP1, and dseEF1α, were screened. Out of them, dsRACK1 interacted with dsSAHH，which was confirmed by Far-western bolt and His pull-down. Conclusion: dsSAHH could interact with dsRACK1.

S-腺苷高半胱氨酸水解酶(S-adenosyhomocystine hydrolase, SAHH)是生物體內(nèi)廣泛存在的一種蛋白水解酶，是甲基化通路中催化S-腺苷高半胱氨酸水解的惟一酶[1]。鑒于它在調(diào)節(jié)生物體轉(zhuǎn)甲基化反應(yīng)中的核心位置，目前已經(jīng)被選作多種新藥研發(fā)的重要潛在作用靶點[2]。單細胞綠藻杜氏鹽藻是一種高度耐鹽的單細胞真核生物，具有一對等長的鞭毛。研究[3]發(fā)現(xiàn)杜氏鹽藻SAHH(dsSAHH)蛋白參與了杜氏鹽藻鞭毛的組裝過程。為了進一步研究dsSAHH在杜氏鹽藻鞭毛組裝過程中的作用機制，作者利用已構(gòu)建酵母雙雜交的誘餌載體pGBKT7-dsSAHH[4]對杜氏鹽藻cDNA文庫進行篩選來釣取與dsSAHH相互作用的蛋白質(zhì)，為研究杜氏鹽藻中甲基化過程以及甲基化過程在杜氏鹽藻鞭毛組裝過程中的作用打下基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1 材料DH5α、杜氏鹽藻cDNA文庫、pET28a(+)載體和pGEX 6p-1載體均為鄭州大學(xué)細胞生物學(xué)研究室保存；pMD18-T載體、限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、Hind Ⅲ、BamHⅠ、NotⅠ和DNA Marker 均購于大連TaKaRa公司；YPD液體和固體培養(yǎng)基以及DO Supplement系列均購于上海睿星基因技術(shù)有限公司；Yeast Nitrogen Base、X-α-gal、DMSO、IPTG、Ni-IDA SefinoseTM試劑盒和GST-IDA SefinoseTM試劑盒等均購于上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。酵母菌株AH109及Y187、酵母雙雜交所用載體、對照質(zhì)粒、酵母質(zhì)粒提取試劑盒均購于Clontech公司。

1.2SAHH相互作用蛋白的篩選

1.2.1誘餌載體篩選cDNA文庫將含有pGBKT7-SAHH誘餌載體的Y187酵母細胞和1 mL文庫菌共培養(yǎng)，并鏡檢是否形成三葉草狀配子，然后分別取200 μL的雜交液涂布50個直徑15 cm的SD/-Trp-Leu-His-Ade/3-AT(5 mmol/L)培養(yǎng)基，30 ℃孵育6～8 d。待在SD/-Trp-Leu-His-Ade/3-AT(5 mmol/L)/X-α-gal的四缺培養(yǎng)基上長出克隆后，挑取直徑大于2 mm的白色或粉色菌落并再次劃線于SD/-Trp-Leu-His-Ade/3-AT(5 mmol/L)/X-α-gal的四缺培養(yǎng)基上，多次傳代并穩(wěn)定表達的為陽性克隆。合成pGADT7載體上多克隆位點兩端序列作為上下游引物：STMARTⅢ，5’-AAGCAGTGGTATCAACG CAGAGTGGCCATTATGGCC-3’；CDSⅢ，5’-TCTA GAGGCCGAGGCGGCCGACATG-3’。并以此對引物對陽性克隆進行菌落PCR擴增，亞克隆至pMD18-T載體，而后轉(zhuǎn)化DH5α，酶切鑒定并比對結(jié)果。

1.2.2回交實驗選擇含有dsRACK1的酵母菌落，劃線到新的SD/-Trp-Leu-His-Ade/3-AT(5 mmol/L)固體培養(yǎng)基，選擇直徑大于2 mm 的酵母菌落提取質(zhì)粒。然后將其提取的酵母質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5α并涂布含有Ampr的LB固體培養(yǎng)基，然后提取質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶Hind Ⅲ酶切鑒定正確后送公司測序。

將提取的獵物質(zhì)粒pGADT7-dsRACK1與誘餌載體pGBKT7-dsSAHH用醋酸鋰法共轉(zhuǎn)化酵母細胞AH109，涂布于SD/-Trp-Leu培養(yǎng)基，同時做陽性對照(質(zhì)粒pGBKT7-53和 pGADT7-Rec-LargeT)和陰性對照(質(zhì)粒pGBKT7-53與pGADT7-Rec-Lam)實驗。培養(yǎng)3～5 d長出白色克隆后，將其劃線到SD/-Trp-Leu-His-Ade/X-α-gal培養(yǎng)基上，繼續(xù)培養(yǎng)并觀察結(jié)果。

1.3dsSAHH相互作用蛋白的驗證

1.3.1dsRACK1基因擴增及蛋白質(zhì)表達和純化采用Trizol試劑法提取杜氏鹽藻總RNA[5]，采用TaKaRa 公司的5’RACE試劑盒合成5’RACE模板，設(shè)計RACK1 5’引物，擴增RACK1的全長。然后設(shè)計引物構(gòu)建重組表達載體pGEX 6p-1-dsRACK1。將pGEX 6p-1-dsRACK1重組質(zhì)粒和已構(gòu)建的pET28a-dsSAHH分別轉(zhuǎn)化BL21 DE3[6]，挑取單菌落分別接種到含有相應(yīng)抗生素的4 mL LB培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)約8 h后，以150接種擴大培養(yǎng)2 h后加入IPTG(終濃度為0.05 mmol/L)，16 ℃過夜誘導(dǎo)蛋白表達。收集細菌后超聲磨碎，收集沉淀和上清，SDS-PAGE檢測蛋白，考馬斯亮藍G-250染色，確定重組蛋白的大小及是否為可溶性蛋白質(zhì)。

將含有目的蛋白質(zhì)的可溶性蛋白質(zhì)分別進行純化，pGEX 6p-1-dsRACK1含有GST標(biāo)簽，使用GST-IDA Sefinose試劑盒純化dsRACK1；pET28a(+)-dsSAHH上含有His標(biāo)簽，用Ni-IDA Sefinose試劑盒純化dsSAHH。

1.3.2Far-western blot實驗將純化的dsRACK1蛋白經(jīng)SAS-PAGE后，將凝膠上的蛋白質(zhì)用半干法轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上后，并進行膜上的原位逐步復(fù)性[7]：將膜依次在鹽酸胍濃度依次降低(6.0、3.0、1.0、0.1 mol/L)的復(fù)性緩沖液TNAB中溫育30 min后，將膜轉(zhuǎn)移至TNAB中4 ℃過夜。然后將膜放置在純化的SAHH蛋白質(zhì)封閉液中孵育3 h，TBST漂洗3次后再與SAHH多克隆抗體(一抗)封閉液室溫振蕩孵育1 h，室溫下用TBST洗膜，再與辣根過氧化物標(biāo)記的山羊抗兔抗體(二抗)室溫溫育1 h，最后用ECL發(fā)光顯色后曝光掃描。

1.3.3His pull-down及非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳將純化的SAHH蛋白質(zhì)重新掛柱，然后將純化的dsRACK1加入到預(yù)裝柱中，4 ℃過夜孵育，然后用洗脫液將多余的dsRACK1洗脫，最后用洗脫液將dsSAHH從柱子上洗脫下來，收集蛋白質(zhì)。

將pull-down洗脫的蛋白質(zhì)用4×上樣Buffer稀釋，配制60 g/L的非變性聚丙烯酰胺凝膠(不含SDS)，為防止蛋白質(zhì)變性，將電泳槽置于冰上，100 V電壓不加樣品預(yù)跑1 h后再加入樣品，濃縮膠電壓為200 V，分離膠電壓為250 V，凝膠用考馬斯亮藍G-250染色、掃描。

1.3.4免疫共沉淀分別構(gòu)建pCMV-HA-dsSAHH和pCMV-Myc-dsRACK1質(zhì)粒，經(jīng)鑒定正確后，提取大量質(zhì)粒。按照說明書，pCMV-HA-dsSAHH和pCMV-Myc-dsRACK1質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染至COS-7細胞中。培養(yǎng)2 d后提取COS-7細胞總蛋白，將細胞裂解產(chǎn)物與已和Myc抗體孵育過的瓊脂糖蛋白小珠A充分混合，用洗脫液將免疫復(fù)合物洗脫，用已制備的抗-dsSAHH抗體采用Western blot檢測免疫復(fù)合物中的dsSAHH，而共轉(zhuǎn)染pCMV-HA和pCMV-Myc的COS-7蛋白為陰性對照。

2結(jié)果

2.1誘餌載體同cDNA文庫雙雜交轉(zhuǎn)化有誘餌質(zhì)粒pGBKT7-dsSAHH的酵母細胞Y187與轉(zhuǎn)化pGADT7-文庫質(zhì)粒的酵母細胞AH109雜交20 h后，取少量的雜交液鏡檢可看到三葉草狀的二倍體酵母細胞，說明酵母雙雜交成功。

酵母雙雜交液涂布SD/-Trp-Leu-His-Ade/3-AT的培養(yǎng)基進行初步篩選，培養(yǎng)6～8 d后，挑取255個較大的克隆劃線SD/-Trp-Leu-His-Ade/3-AT/X-α-gal培養(yǎng)基，后經(jīng)過多次穩(wěn)定傳代得到8個陽性克隆。以CDS Ⅲ和STMART Ⅲ為引物對陽性克隆進行PCR擴增, 連接載體酶切測序，通過Blast得到3個可能與dsSAHH相互作用的克隆，經(jīng)測序后初步鑒定為dsRACK1、甲硫氨酰氨肽酶(dsMetAP1)和真核延伸因子1α(dseEF1α)(圖1)。

M:Marker；1：dsRACK1；2：dseEF1α；3：dsMetAP1。圖1　以CDS Ⅲ和STMART Ⅲ為引物對陽性克隆酵母行PCR檢測結(jié)果

2.2回交實驗驗證dsSAHH與dsRACK1在酵母內(nèi)相互作用提取pGADT7-dsRACK1質(zhì)粒，Hind Ⅲ酶切結(jié)果見圖2，測序結(jié)果提示正確。

1: pGADT7-dsRACK1酶切結(jié)果；2:pGADT7-dsRACK1；M:Marker。圖2　質(zhì)粒pGADT7-dsRACK1被Hind Ⅲ酶切的結(jié)果

將提取的酵母質(zhì)粒pGADT7-dsRACK1和誘餌質(zhì)粒pGBKT7-dsSAHH用醋酸鋰法共轉(zhuǎn)化酵母細胞AT109并涂布SD/-Trp-Leu-His-Ade/3-AT培養(yǎng)基培養(yǎng)3～5 d，挑取生長良好的菌落再次劃線SD/-Trp-Leu-His-Ade/3-AT/X-α-gal培養(yǎng)基培養(yǎng)，細胞生長良好且變藍。

2.3與dsSAHH相互作用蛋白的驗證

2.3.1dsRACK1全長的獲得及蛋白表達采用5’RACE試劑盒合成的5’RACE模板，設(shè)計引物擴增得到RACK1基因序列全長957 bp(GenBank:JN540811)。并成功構(gòu)建帶有GST標(biāo)簽的融合表達載體pGEX 6p-1-dsRACK1(圖3)，同時誘導(dǎo)表達了pGEX 6p-1-dsRACK1和pET28a(+)-dsSAHH，通過一系列條件優(yōu)化均獲得了可溶性的融合蛋白，并分別進行了純化(圖4)。

2.3.2體外驗證dsSAHH與dsRACK1的相互作用

①Far-western blot：結(jié)果見圖5A，dsRACK1在膜上變性的條件下可以和dsSAHH相互作用。②非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳：結(jié)果見圖5B，在2個蛋白大小上面還有一團聚合狀的蛋白質(zhì)存在，說明dsRACK1和dsSAHH在體外活性條件下存在相互作用。

2.3.3體內(nèi)驗證dsSAHH與dsRACK1的相互作用

將pCMV-HA-dsSAHH和pCMV-Myc-dsRACK1質(zhì)粒共轉(zhuǎn)到Cos-7細胞，dsSAHH和dsRACK1在Cos-7細胞中共表達(圖5C)，即dsSAHH和dsRACK1在細胞內(nèi)也能相互作用。

1：pGEX 6p-1-dsRACK1酶切結(jié)果；2：pGEX 6p-1-dsRACK1質(zhì)粒；M：Marker。圖3　pGEX 6p-1-dsRACK1酶切圖

M：Marker；1：pET28a(+)空載體純化結(jié)果；2：dsSAHH純化結(jié)果(左)。M：Marker；1：dsRACK1純化結(jié)果(右)。圖4　dsSAHH和dsRACK1純化

A：Far-western blot結(jié)果，NC表示陰性對照；B：pull-down結(jié)果，1和2為洗脫下來的相互作用蛋白；C：免疫共沉淀結(jié)果。圖5 dsSAHH和dsRACK1相互作用的驗證結(jié)果

3討論

在酵母雙雜交系統(tǒng)中，酵母細胞作為真核細胞為2個相互作用的蛋白質(zhì)提供了更接近于天然構(gòu)象和功能的蛋白[7-8]。其相互作用比較靈敏，假陽性較高，因此需要進一步的實驗來驗證酵母雙雜交的結(jié)果，一般方法有pull-down和免疫共沉淀。

該研究用已構(gòu)建的pGBKT7-dsSAHH誘餌載體在Y187酵母細胞中表達了dsSAHH蛋白，與含有杜氏鹽藻cDNA文庫的AH109酵母細胞進行了2次雜交：第1次篩選出了dsRACK1，第2次篩選出了dsRACK1以及dsMetAP1和dseEF1α共3個蛋白質(zhì)。通過了2次雜交實驗減少了酵母雙雜交的假陽性，因此作者選擇了dsRACK1來進行回交實驗，并且對dsRACK1進行蛋白表達，通過Far-western blot和pull-down實驗證明dsRACK1與dsSAHH在體內(nèi)、外都存在相互作用。

為了更好地了解dsSAHH和dsRACK1之間的相互作用，作者分別將dsSAHH和dsRACK1氨基酸序列在NCBI上進行比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)dsSAHH具有保守的NAD+結(jié)合位點，這與它的水解功能是密不可分的，而dsRACK1的蛋白序列包含一個WD40結(jié)構(gòu)域，是WD40家族蛋白。RACK1最初被認為是蛋白激酶C的受體[9]，酵母和哺乳動物中RACK1的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和翻譯調(diào)控作用已得到證實[10]，但目前認為RACK1同多個信號蛋白有關(guān)系[11-15]。基于該研究結(jié)果，作者推測dsSAHH可能通過與dsRACK1相互作用參與鞭毛的組裝過程。在后續(xù)的研究中作者將要制備dsRACK1的抗體，通過分子生物學(xué)手段來研究dsRACK1在杜氏鹽藻鞭毛再生中的作用及dsSAHH-dsRACK1的相互作用對鞭毛再生的影響。

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*科技部國際科技合作基金資助項目2007DFA01240；河南省高等學(xué)校重點科研項目計劃15A310028，15A180022

Screening of proteins that interact with S-adenosyhomocystine hydrolase by yeast two-hybrid assay inDunaliellasalinacDNA library

1)CollegeofLifeSciences,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou4500012)ClinicalLaboratory,theSecondAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450014

Key wordsS-adenosyhomocystine hydrolase;yeast two-hybrid;protein interaction;co-immunoprecipitation

中圖分類號Q781

通信作者#，女，1969年2月生，博士，教授，研究方向：生物醫(yī)學(xué)，E-mail：guanfangxia@126.com

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.01.002