高血壓大鼠心肌組織中睪酮受體蛋白的表達*

李　淵，王　穎#，燕樹勛，楊國杰，張彥周，孫麗娜，于超男，楊曉村

1)鄭州大學第一附屬醫院老年醫學科 鄭州 450052　2)河南省高等學校臨床醫學重點學科開放實驗室 鄭州 450052　3)河南中醫學院第一附屬醫院內分泌科 鄭州 450008　4)鄭州大學第一附屬醫院心內科 鄭州 450052

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高血壓大鼠心肌組織中睪酮受體蛋白的表達*

李淵1，2)，王穎1，2)#，燕樹勛3)，楊國杰1，2)，張彥周4)，孫麗娜1，2)，于超男1，2)，楊曉村1，2)

1)鄭州大學第一附屬醫院老年醫學科 鄭州 4500522)河南省高等學校臨床醫學重點學科開放實驗室 鄭州 4500523)河南中醫學院第一附屬醫院內分泌科 鄭州 4500084)鄭州大學第一附屬醫院心內科 鄭州 450052

關鍵詞睪酮受體；心肌重構；絲裂素活化蛋白激酶磷酸酶1；大鼠

摘要目的：探討高血壓心肌重構中睪酮受體表達水平改變的意義。方法：以“兩腎一夾”法制備高血壓大鼠模型。實驗分為3組：對照組(n=10，不給予任何處理)、假手術組(n=10)和模型組(n=10)。術后8周，HE染色觀察大鼠心肌組織形態學變化，免疫組化法檢測心肌組織中睪酮受體及絲裂素活化蛋白激酶磷酸酶1(MKP-1)蛋白的表達。結果：與對照組和假手術組相比，模型組心肌纖維排列紊亂，部分心肌纖維斷裂，心肌表現為不同程度肥大或變性，睪酮受體及MKP-1蛋白表達水平降低(P<0.05)，且二者存在線性正相關關系(r=0.657，P=0.039)。結論：睪酮受體參與了高血壓心肌重構的過程，其作用機制可能與絲裂素活化蛋白激酶信號轉導通路有關。

AbstractAim: To explore the role of testosterone receptor in hypertension myocardial remodeling.Methods: Thirty rats were allocated into three groups:control group，sham operation group，and model group(the rats were to establish hypertension model),with ten rats in each group.Eight weeks after operation,the morphological change in myocardial tissue was observed under light microscope, and the expression levels of testosterone receptor and MKP-1 were tested by immunohistochemistry.Results: Compared with the sham operation group and control group, the myocardial fibers of model group disarrayed with some broken,varying degrees of myocardial hypertrophy of degeneration,and the expression levels of testosterone receptor and MKP-1 in myocardial tissue decreased significantly(P<0.05),and they were positively correlated(r=0.657，P=0.039).Conclusion: The testosterone receptor might take part in myocardial remodeling which links with the MAPKs signal transduction pathway.

高血壓心肌重構是多種心血管疾病發生發展過程中的獨立危險因素，對其機制的研究意義重大[1]。睪酮是人體內最重要的性激素，主要通過睪酮受體發揮作用，二者之間存在著負反饋調節[2]。近幾年國內關于睪酮受體在心血管系統中的作用研究較多，但對于心肌重構過程中心肌睪酮受體具體的作用機制尚無定論。絲裂素活化蛋白激酶系統(mitogen-activated protein kinases,MAPKs)是體內多種細胞信號傳遞的共同通路，可通過多種途徑參與高血壓心肌重構，而MAPKs磷酸酶1(MKP-1)是MAPKs滅活的重要途徑[3]。該研究擬以“兩腎一夾”腎性高血壓大鼠為模型，觀察睪酮受體及MKP-1蛋白在腎性高血壓大鼠心肌重構過程中表達水平的變化，進而探討睪酮受體在心肌重構過程中的作用。

1材料與方法

1.1實驗動物、試劑及儀器28日齡Wistar雄性大鼠(0008508)30只，由鄭州大學實驗動物中心提供。ALC-NIBP無創尾動脈血壓測定系統(上海奧爾科特生物科技有限公司)。RM-245石蠟包埋切片機(德國徠卡公司)，DNP-9082電熱恒溫箱(上海精宏公司)，電子天平、DP71型光學顯微鏡(日本OLYMPUS公司)，微波爐(中國格蘭仕公司)，手術器械等。兔抗鼠睪酮受體抗體(sc-816)、鼠抗MKP-1抗體(sc-271684)、兔抗鼠IgG(sc-66931)均為圣克魯斯生物技術公司產品， DAB顯色試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)，其他試劑為市售。

1.2實驗分組及標本采集大鼠適應性喂養1周后，隨機分為3組。模型組大鼠用水合氯醛經腹腔麻醉后，仰臥位固定在動物手術臺上;鈍性分離左腎動脈，放置內徑為0.2 mm的銀夾并打結固定，關閉腹腔;術后腹腔注射青霉素3 d預防感染。假手術組操作方法同上，但不放置銀夾。對照組不給予手術處理。分別于術前、術后1周、術后2周、術后3周、術后8周測大鼠尾動脈血壓。術后4周平均收縮壓大于120 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)或者較術前平均收縮壓升高>20 mmHg，判定為腎性高血壓大鼠造模成功[4]。

1.3觀測指標

1.3.1左心室質量指數8周后，所有實驗動物在深度麻醉下，開胸取出心臟，用冰生理鹽水沖洗，濾紙拭干，稱量全心濕質量及左心室濕質量(除室間隔及左心室外的其余組織)，計算左心室質量指數。

1.3.2心肌形態學觀察左心室稱重后，用中性甲醛固定，心肌組織石蠟包埋，常規制片，HE染色，光鏡下觀察。

1.3.3心肌組織中睪酮受體及MKP-1蛋白的檢測烤片、微波爐抗原修復、血清封閉，一抗孵育(睪酮受體抗體和鼠抗MKP-1抗體均按1100稀釋)、4 ℃過夜，二抗孵育(兔抗鼠IgG抗體)，DAB顯色，中性樹膠封片，顯微鏡下采集圖片并應用光密度軟件(Image-Pro Plus6.0)進行分析。

1.4統計學處理采用SPSS 17.0進行數據處理。采用重復測量數據的方差分析比較3組不同時期血壓水平；3組心肌組織中睪酮受體及MKP-1蛋白表達水平的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗；采用Pearson相關分析睪酮受體和MKP-1蛋白表達的相關性，檢驗水準α=0.05。

2結果

2.13組大鼠血壓的比較模型組均造模成功。8周內，對照組和假手術組血壓值無明顯變化，模型組血壓逐漸升高，見表1。

表1　3組大鼠不同時期的血壓　mmHg

F組間=1 211.779，F時間=1 613.225,F交互=1 537.050，P均<0.001。

2.23組心肌形態學變化見圖1。對照組大鼠心肌細胞完整,肌纖維排列整齊；假手術組同對照組相比無明顯差異；模型組大鼠心肌纖維部分斷裂,排列紊亂,心肌細胞腫脹或有核固縮、消失，心肌間結締組織增多。

A：假手術組；B：對照組；C：模型組。圖1　3組大鼠心肌形態學變化(HE,×400)

2.33組左心室質量指數的比較見表2。與假手術組和對照組相比，模型組左心室質量指數明顯升高。

A：假手術組；B：對照組；C：模型組。圖2　3組睪酮受體(1)及MKP-1蛋白(2)的表達(免疫組化，×400)

2.43組心肌組織中睪酮受體和MKP-1蛋白表達水平的比較見圖2及表2。對照組、假手術組、模型組心肌組織中均有睪酮受體和MKP-1蛋白表達。與對照組相比，假手術組兩種蛋白的表達水平無明顯變化；模型組兩種蛋白的表達水平較對照組和假手術組明顯降低。

表2　術后8周3組左心室質量指數、

*：與對照組和假手術組相比，P<0.05。

2.5模型組大鼠心肌組織中睪酮受體蛋白與MKP-1蛋白表達的相關性分析模型組中睪酮受體蛋白與MKP-1蛋白表達水平呈正相關(r=0.657,P=0.039)。

3討論

研究[5]證實，生理劑量的睪酮可以抑制血管緊張素Ⅱ誘導的心肌成纖維細胞的增殖，提示睪酮對心血管系統有保護作用，且其機制與MAPKs有關。睪酮的作用主要是通過睪酮受體實現的，睪酮受體主要分布于細胞核，既可以與進入胞內的睪酮特異性結合發揮效應，又可以通過EGRF、IGRF、G蛋白偶聯途徑改變胞內磷酸酶和激酶的活性，產生不依賴睪酮的作用，還可以通過與c-Jun、c-Fos、Spl和NF-kB的相互作用發揮調控功能[6]。研究[7]證實睪酮受體參與了包括動脈粥樣硬化、前列腺增生、肥胖、糖尿病等多種疾病的發生發展過程。關于睪酮受體在心血管系統中的作用尚未達成共識，有研究[8-9]稱通過抑制睪酮受體可以在一定程度上抑制動脈粥樣硬化的發生與發展，但亦有研究[10]認為睪酮受體可以通過RAS系統對血壓產生影響。

MAPKs是多種胞外信號引起細胞增殖、增生、肥大的胞內信號傳遞的匯聚點和共同通路,其參與高血壓心肌重構的過程主要是通過P38通路、ERK通路和JNK通路[11]3種途徑來實現的。MKP-1是MAPKs滅活的重要途徑。高血壓心肌重構不僅與MAPKs的過度激活有關，還涉及MAPKs的滅活障礙[12-14]。

作者以腎性高血壓大鼠為研究對象，觀察了其心肌組織中睪酮受體和MKP-1蛋白的表達情況。研究結果顯示：與對照組和假手術組相比，模型組心肌組織中睪酮受體和MKP-1蛋白表達水平降低，提示二者可能參與了高血壓心肌重構的過程；心肌組織中二者的表達存在線性正相關，提示睪酮受體蛋白參與高血壓心肌重構的過程可能與MKP-1途徑有關。

綜上所述，睪酮受體和MKP-1蛋白表達水平在高血壓心肌重構過程中均發生了改變，二者呈正相關，睪酮受體對高血壓心肌重構的作用機制與MAPKs通路有關，二者共同作用于高血壓心肌重構的發生發展過程。

參考文獻

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*國家留學基金委河南省地方合作項目201308410293；河南省科技廳基礎與研究項目132300410464；河南省教育廳科學技術研究重點項目基礎研究計劃13A320436；河南省衛生科技創新型人才工程中青年科技創新人才項目4099；河南省衛生廳及鄭州大學第一附屬醫院共建青年創新基金項目(2009年)；河南省醫學科技攻關計劃項目2011020038

Expression of testosterone receptor in myocardial tissue from hypertensive rats

LIYuan1，2)，WANGYing1，2)，YANShuxun3)，YANGGuojie1，2)，ZHANGYanzhou4)，SUNLina1，2)，YUChaonan1，2)，YANGXiaocun1，2)

1)DepartmentofGeriatrics，theFirstAffiliatedHospital，ZhengzhouUniversity，Zhengzhou4500522)Key-DisciplinesLaboratoryofClinical-MedicineofHenan，Zhengzhou4500523)DepartmentofEndocrinology，theFirstAffiliatedHospital，HenanCollegeofTraditionalChineseMedicine，Zhengzhou4500084)DepartmentofCardiology，theFirstAffiliatedHospital，ZhengzhouUniversity，Zhengzhou450052

Key wordstestosterone receptor；myocardial remodeling；mitogen-activated protein kinase phosphatase 1;rat

中圖分類號R543.2

通信作者#，女，1974年6月生，博士，教授，副主任醫師，研究方向：心肌重構的機制及防治，E-mail：2414714561@qq.com

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.01.005