光照強度及鹽濃度對杜氏鹽藻生長及β-胡蘿卜素積累的影響*

劉　真，劉姍姍，張玉潔，朱相展，張彥婷，李慶華，馬珊珊，張　琨，關方霞

1)鄭州大學生命科學學院 鄭州 450001　2)鄭州大學第一附屬醫院干細胞實驗室 鄭州 450052

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光照強度及鹽濃度對杜氏鹽藻生長及β-胡蘿卜素積累的影響*

劉真1)，劉姍姍1)，張玉潔1)，朱相展1)，張彥婷1)，李慶華1)，馬珊珊1)，張琨1)，關方霞1,2)#

1)鄭州大學生命科學學院 鄭州 4500012)鄭州大學第一附屬醫院干細胞實驗室 鄭州 450052

關鍵詞杜氏鹽藻；β-胡蘿卜素

摘要目的：探討光照強度和鹽濃度對杜氏鹽藻生長和細胞內β-胡蘿卜素積累的影響。方法：檢測正常培養條件下杜氏鹽藻生長情況和β-胡蘿卜素變化，不同濃度(0.5、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mol/L)NaCl培養后細胞內β-胡蘿卜素的積累情況。采用高光(5 000～6 000 Lux)、高鹽(3.5 mol/L NaCl)及高光高鹽條件對培養至對數生長末期的杜氏鹽藻進行β-胡蘿卜素積累的誘導。結果：正常條件下杜氏鹽藻培養2 周后進入穩定期，細胞內β-胡蘿卜素含量呈先下降后上升趨勢，第9 天達到最大值，隨后出現小幅度波動；杜氏鹽藻細胞內β-胡蘿卜素含量隨NaCl濃度升高而升高，二者呈正相關(r=0.969，P<0.001)。與正常條件相比，高光、高鹽單獨作用均能夠提高細胞內β-胡蘿卜素含量，而高光高鹽聯合作用最有利于杜氏鹽藻細胞β-胡蘿卜素的積累。結論：高光高鹽聯合作用可作為杜氏鹽藻細胞內β-胡蘿卜素的最佳誘導條件。

AbstractAim: To study the effects of light and salt concentration on the growth of Dunaliella salina and intracellular accumulation of β-carotene. Methods: The growth of Dunaliella salina and change of β-carotene content were measured under normal culture conditions. And the accumulation of β-carotene under different salt concentrations(0.5，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5 mol/L) was detected. Then high-light(5 000-6 000 Lux), high-salt(3.5 mol/L NaCl) and high-light plus high-salt conditions were used to induce β-carotene accumulation. Results: Under normal conditions, Dunaliella salina grew to the stable phase after 2 weeks of cultivation,the intracellular β-carotene content was decreased at first and then increased,on the 9th day the content reached a maximum followed by a slight fluctuation. The β-carotene content of cells increased with increasing salt concentration, indicating that the two indexes were positively correlated(r=0.969，P<0.001). Furthermore, the results of induction experiments showed that the β-carotene content increased in both high-light and high-salt conditions, compared with normal conditions. And the combination of high-salt and high-light was most favorable to β-carotene accumulation. Conclusion: The combined high-light and high-salt might be the optimal induction conditions for β-carotene accumulation in Dunaliella salina,which provides a theoretical basis for the industrial production of Dunaliella salina.

杜氏鹽藻是一種極具經濟價值的單細胞真核綠藻[1-2]，它主要分布在海洋、鹽湖等鹽水水體中[3]，是目前世界上最耐鹽的真核光合生物[4]。在一定條件下，β-胡蘿卜素含量可高達杜氏鹽藻細胞干重的10%左右[5]，因而杜氏鹽藻是目前公認的商業化生產天然β-胡蘿卜素的理想資源。β-胡蘿卜素是一種親脂性的高價值化合物[6]，作為著色劑、抗氧化劑和抗衰老劑，被廣泛應用在食品、化妝品和制藥工業[7-9]。β-胡蘿卜素具有清除氧自由基的能力[10]，是維護人體健康不可缺少的營養物質，在抗癌、預防心血管疾病、白內障及抗氧化方面具有顯著的作用，可防止老化和衰老引起的多種退化性疾病[11-12]。目前，包括美國、以色列、澳大利亞、印度等在內的許多國家都相繼開展了大規模鹽藻β-胡蘿卜素生產特性研究，并已進入商業化生產[13-15]。我國具有漫長的海岸線和許多內陸鹽湖，具有培養杜氏鹽藻，生產β-胡蘿卜素的得天獨厚的自然條件。該研究以杜氏鹽藻UTEX-1644為對象，通過觀察杜氏鹽藻在正常條件和不同鹽濃度培養過程中β-胡蘿卜素含量的變化，并比較高光、高鹽及高光高鹽3種脅迫條件下β-胡蘿卜素的積累情況，探討杜氏鹽藻β-胡蘿卜素的積累規律，從而確定β-胡蘿卜素積累的最佳條件，為建立高產β-胡蘿卜素的杜氏鹽藻提供理論依據。

1材料與方法

1.1藻種與主要試劑杜氏鹽藻藻株為UTEX-1644，購自美國Texas大學。NaCl、KNO3、MgSO4、KH2PO4、FeCl3、CaCl2、丙醇等均為國產分析純。

1.2杜氏鹽藻培養杜氏鹽藻培養使用UTEX-1644液體培養基，培養基組成包括：NaCl 1.5 mol/L，KNO350 mmol/L，MgSO42 μmol/L，KH2PO45 mmol/L，FeCl36 μmol/L，CaCl25 mmol/L，微量元素母液。通過調節NaCl含量改變培養基鹽濃度。配制完成后進行高壓蒸汽滅菌(121 ℃、30 min)，完成后待其冷卻，用0.1 mol/L的NaHCO3調pH至7.5左右。培養條件：取對數生長期杜氏鹽藻接種于含有100 mL UTEX-1644培養基的250 mL三角瓶中，置于光照培養箱進行培養，溫度25.7 ℃，光暗比12 h12 h，光照強度3 000～4 000 Lux，每天振蕩2次。

1.3不同NaCl濃度對杜氏鹽藻細胞β-胡蘿卜素含量的影響將杜氏鹽藻于含不同濃度(0.5、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mol/L)NaCl的UTEX-1644培養基中培養14 d，于對數生長期末收集并檢測杜氏鹽藻細胞中β-胡蘿卜素的含量。

1.4脅迫條件下誘導β-胡蘿卜素積累杜氏鹽藻藻液一部分分裝于250 mL培養瓶中，每瓶100 mL，分別在正常條件(光強3 000～4 000 Lux，NaCl 1.5 mol/L)、高光培養條件(光強5 000～6 000 Lux，NaCl 1.5 mol/L)下誘導β-胡蘿卜素的積累；另一部分離心，重懸后分裝于含有100 mL UTEX-1644液體培養基的250 mL培養瓶中，分別在正常條件(光強3 000～4 000 Lux，NaCl 1.5 mol/L)、高鹽培養條件(光強3 000～4 000 Lux，NaCl 3.5 mol/L)及高光高鹽條件(光強5 000～6 000 Lux，NaCl 3.5 mol/L)下誘導β-胡蘿卜素的積累，每組重復3次。

1.5鹽藻細胞密度的測定取1 mL藻液，加入0.2 mL甲醛固定，血細胞計數板進行細胞計數，重復3次。同時，測定同一樣品在750 nm處的吸光度，重復3次。以光密度(OD750 nm)值為橫坐標、藻細胞密度為縱坐標繪制細胞密度-光密度標準曲線。

1.6β-胡蘿卜素含量的測定取1.5 mL藻液離心去上清，加入體積分數80%的丙酮，使藻體充分溶解在丙酮液體中，黑暗環境下靜置5 min，離心，使沉淀呈灰白色，測定上清450 nm處吸光度(A450 nm)值。根據Jensen公式[16]換算出每個細胞中β-胡蘿卜素的含量。

2結果

2.1杜氏鹽藻細胞密度與光密度關系見圖1，杜氏鹽藻的細胞密度與OD750 nm具有較好的線性關系。

圖1　杜氏鹽藻細胞密度與光密度(OD750 nm)值關系

2.2杜氏鹽藻在正常條件下的生長情況及β-胡蘿卜素含量變化正常條件下培養，鹽藻細胞在接種后的5 d左右進入對數生長期，可維持1周左右;在第14天左右達到對數生長末期，之后進入穩定期(圖2)。培養初期每細胞內β-胡蘿卜素含量驟減，隨后逐漸增加，在第9 天達到最大值，之后隨著培養時間的延長呈小幅度波動(圖3)。

圖2　正常條件下杜氏鹽藻的生長曲線

圖3　正常條件下杜氏鹽藻細胞中β-胡蘿卜素的含量變化

2.3杜氏鹽藻在不同NaCl濃度下β-胡蘿卜素的積累變化隨著鹽濃度的升高，單個細胞中β-胡蘿卜素含量不斷增加，二者呈正相關(r=0.969,P<0.001)。

2.4杜氏鹽藻在誘導環境下β-胡蘿卜素的積累情況將培養至對數生長末期的杜氏鹽藻細胞分別轉入高光、高鹽、高光高鹽三種條件下進行誘導，細胞內β-胡蘿卜素含量見圖4。結果顯示，轉入高光誘導條件下，細胞內β-胡蘿卜素含量迅速增加，3 h時達到最大值，隨后逐漸下降至正常水平。正常培養下細胞內β-胡蘿卜素含量增幅較小。轉入高鹽和高光高鹽誘導條件后，由于離心和更換新鮮培養基，為適應細胞損傷和新環境，在更換培養基3 h內，細胞內β-胡蘿卜素含量下降，隨后大幅增加，9 h后趨勢變緩，高光高鹽誘導效果明顯，β-胡蘿卜素含量明顯高于對照組。高光、高鹽單獨作用均能促進細胞中β-胡蘿卜素的積累，且二者聯合作用效果更為顯著。

圖4　不同誘導環境下杜氏鹽藻細胞中β-胡蘿卜素的含量

3討論

β-胡蘿卜素作為微生素A原，是聯合國糧農組織和世界衛生組織食品添加劑聯合專家委員會認定的A類營養食品強化劑。作為藥物，β-胡蘿卜素已被美國藥典、歐洲藥典和英國藥典正式收載。β-胡蘿卜素可降低人癌癥發生率[17]。國內外大量研究[18]證實，β-胡蘿卜素能夠抑制腫瘤形成，具有抗輻射和抵抗某些化學物質致癌的作用。因其具有較好的淬滅單線態氧清除自由基抑制脂質過氧化作用，可用于預防和治療心血管疾病、白內障等多種衰老引起的退化性疾病[19]。

杜氏鹽藻中β-胡蘿卜素是光合作用的捕光輔助色素，并能保護光合作用的反應器不受光抑制[20]。當杜氏鹽藻處于某種不利生長的條件(即脅迫條件)下，就會出現乙酰輔酶A的積累并導致β-胡蘿卜素的合成和積累。在適當條件下，杜氏鹽藻細胞中β-胡蘿卜素含量可達細胞干重的10%(質量分數)[5]。因此，杜氏鹽藻是天然β-胡蘿卜素的理想來源。

該研究結果表明，在正常培養條件下，細胞中能夠積累少量β-胡蘿卜素，且鹽藻生長和β-胡蘿卜素累積存在一定關系，當細胞快速生長時，β-胡蘿卜素的累積較少，而當細胞生長緩慢或生長受到抑制時，β-胡蘿卜素開始大量累積。此外，提高培養基中鹽濃度，能夠顯著影響細胞中β-胡蘿卜素的積累，二者呈正相關。說明高鹽脅迫有利于藻細胞積累β-胡蘿卜素，然而高鹽條件下藻細胞生長受到明顯抑制。實踐中，為提高杜氏鹽藻β-胡蘿卜素產量，需要同時滿足兩方面條件，一是獲得較高的生物量，二是提高單位細胞內β-胡蘿卜素含量。因此，作者選擇在杜氏鹽藻正常培養至對數生長末期，得到較高藻細胞密度后，將細胞轉入脅迫條件下，誘導細胞中β-胡蘿卜素的積累。該研究結果表明，對數生長末期的藻細胞轉入不同條件下誘導后， 高光、高鹽均能夠明顯提高細胞中β-胡蘿卜素含量，且二者共同作用時效果更為顯著。已有研究[20-21]表明，β-胡蘿卜素在光氧化過程中具有清除氧自由基的能力，它能保護光系統免受光氧化的破壞，同時其含量與光合效率指數負相關，因此提高光強能夠有效促進細胞內β-胡蘿卜素的積累。此外，有研究[21]表明，高鹽脅迫過程中細胞內能夠檢測到一種大小約15 000的蛋白的表達，該蛋白參與β-胡蘿卜素合成，但具體作用和機制尚不清楚。同時，該研究結果顯示，相比于高鹽誘導，高光作用能夠在較短時間內對β-胡蘿卜素的積累發揮明顯的促進效果。

綜上所述，通過觀察不同培養條件及不同誘導條件對杜氏鹽藻細胞內β-胡蘿卜素積累的影響，初步確定以高光高鹽聯合作用作為其最佳誘導條件，從而為建立高產β-胡蘿卜素的杜氏鹽藻培養體系提供實驗依據。

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*大學生創新創業訓練計劃項目201410459052

Effects of light intensity and salt concentration on growth of Dunaliella salina and accumulation of β-carotene

LIUZhen1),LIUShanshan1),ZHANGYujie1),ZHUXiangzhan1),ZHANGYanting1),LIQinghua1),MAShanshan1),ZHANGKun1),GUANFangxia1,2)

1)CollegeofLifeSciences,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou4500012)StemCellLaboratory,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

Key wordsDunaliella salina;β-carotene

中圖分類號Q945.1

通信作者#，女，1969年2月生，博士，教授，研究方向：生物醫學，E-mail:guanfangxia@126.com

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.01.008