Slug蛋白、E-鈣黏蛋白在非小細胞肺癌組織中的表達及其與肺癌預后的關系*

岳銀艷，吳秋歌，田文嫻，周　璐，郭亞濤，黃亞輝，王　靜

鄭州大學第一附屬醫院呼吸內科 鄭州 450052

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Slug蛋白、E-鈣黏蛋白在非小細胞肺癌組織中的表達及其與肺癌預后的關系*

岳銀艷，吳秋歌，田文嫻，周璐，郭亞濤，黃亞輝，王靜#

鄭州大學第一附屬醫院呼吸內科 鄭州 450052

關鍵詞Slug蛋白；E-鈣黏蛋白；非小細胞肺癌；無進展生存期

摘要目的：測定非小細胞肺癌組織中Slug蛋白、E-鈣黏蛋白的表達水平，探討二者與肺癌預后的關系。方法：采用免疫組化法檢測68例非小細胞肺癌及30例癌旁組織中Slug蛋白、E-鈣黏蛋白的表達情況。分析2種蛋白表達與臨床病理特征及無進展生存期的關系。結果：非小細胞肺癌組織中Slug蛋白、E-鈣黏蛋白的表達與癌旁組織中的表達相比差異有統計學意義(P<0.001)。Slug蛋白、E-鈣黏蛋白的表達均與非小細胞肺癌的TNM分期、淋巴結轉移有關(P<0.05)。非小細胞肺癌組織中Slug蛋白與E-鈣黏蛋白的表達呈負相關(rS=-0.228，P=0.010)。Slug蛋白陽性表達的患者無進展生存期為11個月，陰性表達的患者為17個月，差異有統計學意義(P=0.036)；E-鈣黏蛋白陽性表達的患者無進展生存期為13個月，陰性表達的患者為11個月，差異具有統計學意義(P=0.003)。結論：Slug蛋白、E-鈣黏蛋白在非小細胞肺癌的進展過程中起重要作用，兩者可能存在相互作用，且與患者無進展生存期密切相關，可作為判斷非小細胞肺癌預后的標志物。

AbstractAim: To investigate the expressions of Slug and E-cadherin and the relationship with the prognosis in non-small-cell lung cancer(NSCLC). Methods: The expressions of Slug and E-cadherin in 68 specimens of NSCLC and 30 specimens of adjacent normal tissue were detected by immunohistochemistry. The relationship among the two kinds of protein expression and clinical pathological parameters and progression free survival(PFS) were analyzed. Results: There were significant difference in the expressions of the two proteins between the lung cancer tissue and adjacent normal tissue(P<0.001). The expressions of Slug and E-cadherin proteins were closely related with TNM stages and lymph node metastasis(P<0.05). The expression of Slug was negatively correlated with that of E-cadherin(rS=-0.228，P=0.010). The PFS of patients with positive expression of Slug protein was 11 months, while patients with negative expression was 17 months. and the difference was significant(P=0.036). The PFS of patients with positive expression of E-cadherin protein was 13 months, while patients with negative expression was 11 months,and the difference was significant(P=0.003). Conclusion: Slug and E-cadherin play important roles in the development of NSCLC, which are closely related with the PFS of NSCLC patients. They might be used as biomarkers in judging the prognosis of NSCLC.

目前，肺癌是世界上引起死亡人數最多的惡性腫瘤，其中非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)約占肺癌的85%[1]。肺癌的轉移特性與其預后密切相關。肺癌的轉移是一個極其復雜的、由多種基因調控的多階段、多步驟過程。其中，上皮細胞-間葉細胞轉型(epithelial-to-mesenchymal transition，EMT)在惡性腫瘤侵襲轉移過程中發揮重要作用，而細胞間的黏附性降低是極其重要的一個步驟。上皮E-鈣黏蛋白(E-cadherin，EC)可抑制腫瘤的轉移，其表達下降或缺失可促進腫瘤細胞的轉移[2]。鋅指轉錄因子Slug蛋白是Snail鋅指轉錄因子家族成員，可以通過與EC啟動子區域的E-boxes結合而抑制EC的表達[3]。作者采用免疫組化SP方法檢測了68例NSCLC標本及30例癌旁組織標本中Slug蛋白和EC表達情況，探討這2種蛋白表達與NSCLC臨床病理特征及預后的關系。

1材料與方法

1.1材料收集2011年1月至2013年4月鄭州大學第一附屬醫院胸外科手術切除的NSCLC標本68例，患者術前均未行放療及化療。所有肺癌組織標本均以體積分數10%甲醛固定，石蠟包埋，經蘇木精-伊紅染色病理學確診。68例患者中，男51例，女17例；年齡39～77(59.76±8.60)歲；病理類型包括鱗癌30例，腺癌38例；有淋巴結轉移者28例，無淋巴結轉移者40例；TNM分期Ⅰ-Ⅱ期51例，Ⅲ期17例。另取其他NSCLC患者的癌旁組織30例作為對照。所有患者術后分別正規化療4周期，化療方案分別為吉西他濱+奧沙利鉑、多西他賽+奈達鉑、培美曲賽+奈達鉑、吉西他濱+奈達鉑、多西他賽+順鉑；均未行生物治療及靶向治療。

1.2Slug和EC蛋白的免疫組化SP法檢測石蠟標本5 μm厚連續切片，實驗步驟嚴格按照說明書進行。Slug、EC兔抗人單克隆抗體均購自北京博奧森生物技術有限公司(均按1300稀釋)，二抗購自北京中杉金橋生物技術有限公司，每批實驗均以北京博奧森公司提供的陽性對照片做陽性對照，以PBS代替一抗做陰性對照。最后以DAB顯色，蘇木精復染，中性樹膠封片，于顯微鏡下觀察染色情況。Slug蛋白陽性染色為細胞核或細胞質內出現棕黃色顆粒；EC蛋白陽性染色為細胞膜和細胞質內出現棕黃色顆粒，部分間質、炎細胞及血管上皮細胞上也可見蛋白染色。參照賀榮芳等[4]描述的分級方法，每例切片選取5個高倍視野進行結果判定。根據細胞被染色強度及染色細胞所占百分比之積來判斷結果。染色強度可分為4級：0分為未見陽性細胞，1分為弱陽性，2分為中等陽性，3分為為強陽性。陽性染色細胞所占百分比可分為5級：0分為無陽性細胞，1分為<10%，2分為10%～，3分為50%～，4分為>80%。其中染色強度與染色細胞所占百分比之積≥3分為陽性，<3為陰性，對相關資料進行定量積分并計算陽性表達率[5]。

1.3統計學處理采用SPSS 15.0進行分析，應用χ2檢驗比較NSCLC組織及癌旁組織中Slug和EC蛋白表達的差異，并分析其與NSCLC患者各臨床病理特征之間的關系，應用Spearman等級相關分析NSCLC組織中Slug和EC蛋白表達的相關性，應用Kaplan-Meier法對NSCLC患者進行單因素生存分析，檢驗水準α=0.05。

2結果

A：腺癌組織；B：鱗癌組織；C：癌旁組織。1：Slug蛋白；2：EC蛋白。 圖1　肺腺癌、鱗癌和癌旁組織中Slug、EC蛋白的表達(SP，×400)

2.1NSCLC組織及癌旁組織中Slug和EC蛋白的表達Slug蛋白陽性表達主要位于細胞核和細胞漿，呈棕黃色(圖1上排)。EC蛋白陽性表達主要位于細胞膜和細胞漿，呈棕黃色(圖1下排)；在NSCLC癌組織及癌旁組織， Slug蛋白的陽性表達率分別為67.6%(46/68)和13.3%(4/30)，差異有統計學意義(χ2=24.573，P<0.001)；EC蛋白的陽性表達率分別為50.0%(34/68)和90%(27/30)，差異有統計學意義(χ2=14.172，P<0.001)。

2.2NSCLC組織中Slug和EC蛋白的表達與臨床病理特征的關系見表1。

表1　Slug和EC蛋白表達與NSCLC臨床病理特征的關系

2.3NSCLC組織中Slug和EC蛋白表達的相關性分析Spearman等級相關分析結果顯示，NSCLC組織中Slug與EC蛋白的表達之間呈負相關(rS=-0.228，P=0.010)。

2.4Slug和EC蛋白表達與無進展生存期(progression-free survival,PFS)的關系見圖2。Slug蛋白陽性與陰性表達的中值PFS分別為11和17個月，2組的PFS曲線比較差異有統計學意義(χ2=4.418，P=0.036)；EC蛋白陽性與陰性表達的中值PFS分別為13和11個月，2組的PFS曲線比較差異有統計學意義(χ2=9.064，P=0.003)。

圖2　Slug蛋白(上)和EC蛋白(下)表達與NSCLC患者PFS的關系

3討論

EMT是胚胎正常發育的一個關鍵步驟，對于原腸胚的發生發育、心臟的形成、神經脊的形成等發揮了重要作用[6]。研究[7]表明EMT可增加細胞侵襲和轉移能力，在腫瘤發生發展中起了極其重要的作用。通過上皮間質轉化，腫瘤細胞獲得間質細胞的特征，從而變得更有活動性和侵襲性[8]。EMT的主要特點之一是上皮細胞表達的位于其細胞膜的黏附分子——EC表達的下調。EC是鈣黏附蛋白分子家族中跨膜蛋白亞型的一種，是經典的轉移抑制因子，對調節細胞黏附具有重要作用[9]。EC低表達或缺失可使腫瘤細胞喪失接觸抑制，導致細胞無限制增殖，失去分化，極易發生浸潤和轉移[10]。該研究結果顯示，在30例癌旁組織中，EC主要位于細胞膜上，表達率為90%，而在腫瘤組織中EC的表達率降低，為50%，且其表達率隨著NSCLC的分期增加而減少，有淋巴結轉移組表達率低于無淋巴結轉移組。其中，EC陽性表達患者的PFS較陰性表達患者長，提示EC的陰性表達可能與腫瘤的轉移及預后密切相關。

EC的表達下調主要通過EC轉錄抑制子與其啟動子的結合而實現[11]。E-鈣黏附轉錄抑制子包括Zeb家族、Snail1、Slug蛋白、Twist等[12]。其中Slug蛋白能識別通用的E2-盒元件以抑制靶基因EC的轉錄。有研究[13]發現，在人乳腺癌細胞系中敲除Slug基因后可以完全阻斷Twist1對EC的轉錄抑制作用，證實Slug蛋白對EC轉錄的抑制作用。該研究結果顯示，腫瘤組織中Slug蛋白的表達高于癌旁組織，有淋巴結轉移組明顯高于無轉移組，Ⅲ期組高于Ⅰ-Ⅱ組，提示Slug蛋白的高表達與腫瘤的發生、浸潤、轉移密切相關。

目前，對Slug和EC蛋白在NSCLC的浸潤及轉移之間關系的研究較少，尤其相關的體內實驗研究更加少見。Fernando等[14]發現在黑色素瘤細胞間質轉化過程中，轉錄因子Slug蛋白可抑制EC的表達，導致腫瘤細胞EMT的發生。Slug蛋白的表達增加和EC的細胞膜表達量減少可能降低腫瘤細胞間的黏附力，使腫瘤細胞失去上皮細胞極性，導致腫瘤細胞的上皮間質轉化，使腫瘤細胞更容易浸潤和轉移；并且通過Slug和EC蛋白兩者之間的相互作用，更有助于腫瘤細胞的浸潤和轉移，與腫瘤的預后密切相關[15-16]。該研究中，Slug蛋白的表達在肺癌組織中高于癌旁組織，與EC蛋白的表達呈負相關，說明Slug蛋白高表達與肺癌發生、轉移相關，與Fernando等[14]研究結果相符。

研究肺癌的預后，可以較為客觀地評價其臨床治療效果，并權衡其治療方法是否恰當。因此，探索肺癌的相關預后指標對于完善多學科綜合治療方案，提高治療效果具有重要意義。作者發現，影響NSCLC患者生存時間的因素包括Slug蛋白表達、EC蛋白表達、分期和轉移情況，而與患者性別、年齡、病理分型無關。由此可推測，Slug、EC蛋白的聯合檢測將有利于臨床上預測患者的預后，并有可能成為判斷肺癌預后的新指標。

參考文獻

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(2015-06-02收稿責任編輯趙秋民)

*河南省科技攻關計劃項目142300410032

Expressions of Slug and E-cadherin in non-small cell lung cancer tissue and its relationship with prognosis

YUEYinyan，WUQiuge，TIANWenxian，ZHOULu，GUOYatao，HUANGYahui，WANGJing

DepartmentofRespiratoryDiseases，theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity，Zhengzhou450052

Key wordsSlug; E-cadherin; non-small-cell lung cancer; progression free survival

中圖分類號R734.2

通信作者#，女，1958年11月生，博士，教授，研究方向：肺癌的發病機制和早期預警，E-mail：wangjing@zzu.edu.cn

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.01.009