HPV-16 L1甲基化和HPV E6/E7 mRNA檢測宮頸病變的臨床價值*

李肖甫，邱　翠，智艷芳，李　雅，榮守華，樊婷婷

鄭州大學第三附屬醫院細胞室 鄭州 450052

△男，1964年7月生，碩士，教授，研究方向:腫瘤細胞病理學診斷，E-mail:lixiaofu1964@163.com

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HPV-16 L1甲基化和HPV E6/E7 mRNA檢測宮頸病變的臨床價值*

李肖甫△，邱翠，智艷芳，李雅，榮守華，樊婷婷

鄭州大學第三附屬醫院細胞室 鄭州 450052

△男，1964年7月生，碩士，教授，研究方向:腫瘤細胞病理學診斷，E-mail:lixiaofu1964@163.com

關鍵詞人乳頭瘤病毒；宮頸病變；HPV-16 L1甲基化；HPV E6/E7 mRNA

摘要目的：探討HPV-16 L1甲基化程度、HPV E6/E7 mRNA表達水平在檢測宮頸病變中的臨床價值。 方法：選擇50例HPV-16感染患者的宮頸脫落細胞學標本，其中CIN1 11例、CIN2 11例、CIN3 21例、宮頸鱗癌(SCC)7例，另取11例病理檢測HPV-16陰性或慢性炎癥者為對照。采用甲基化敏感性高分辨溶解曲線法檢測HPV-16 L1甲基化水平，采用bDNA技術檢測HPV E6/E7 mRNA的表達情況。 結果：對照組、CIN1組、CIN2組、CIN3組和SCC組HPV-16 L1甲基化陽性率分別為9.1%、72.7%、81.8%、90.5%、100.0%，HPV E6/E7 mRNA陽性率分別為45.5%、72.7%、90.9%、100.0%、100.0%；CIN2以上病變中HPV-16 L1甲基化陽性率均高于對照組，而CIN3以上病變中HPV E6/E7 mRNA陽性率均高于對照組(P均<0.005)。HPV-16 L1甲基化程度和HPV E6/E7 mRNA水平均隨宮頸病變嚴重程度的增加而升高(rS=0.638和0.525，P均<0.001)；HPV-16 L1甲基化程度與HPV E6/E7 mRNA表達水平呈正相關(rS=0.420, P=0.001)。結論：HPV-16 L1甲基化與HPV E6/E7 mRNA檢測在分流HPV感染或細胞學陽性患者方面具有良好的臨床應用前景。

AbstractAim: To evaluate the clinical value of HPV-16 L1 methylation and HPV E6/E7 mRNA testing for the detection of cervical lesions.Methods: Fifty cervical cytology samples(11 cases of CIN1, 11 cases of CIN2, 21 cases of CIN3 and 7 cases of SCC). Another 11 samples with histology-negative or chronic inflammation were used as control. The HPV-16 L1 methylation and HPV E6/E7 mRNA levels were detected using MS-HRM assay and bDNA technique, respectively.Results: The overall positive rates of HPV-16 L1 methylation and HPV E6/E7 mRNA for control, CIN1,CIN2,CIN3 and SCC groups were 9.1%,72.7%,81.8%,90.5%,100.0% and 45.5%,72.7%,90.9%,100.0%,100.0%, respectively. The HPV-16 L1 methylation positive rate in CIN2+groups was higher than that of control group, while the HPV E6/E7 mRNA positive rate in CIN3+groups was higher than that of control group(all P<0.005). The HPV-16 L1 methylation degree and HPV E6/E7 mRNA level increased with the severity of cervical lesions(rS=0.638,0.525, all P<0.001). Additionally, the HPV-16 L1 methylation and HPV E6/E7 mRNA level had positive correlation (rS=0.420,P=0.001).Conclusion: The HPV-16 L1 methylation and HPV E6/E7 mRNA testing may have good applied prospect for the triage of women with HPV-infection or cytology-positive in clinical practice.

宮頸癌是威脅女性健康的第三大惡性腫瘤[1]。高危型人乳頭瘤病毒(high-risk human papillomavirus，HR-HPV)持續感染是宮頸上皮內瘤變(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)和宮頸癌發生的主要病因[2-3]。目前已經發現有40種HPV亞型能入侵生殖器官，其中最主要的是HPV-16型，據統計，約50%的宮頸癌病例中能夠發現此型HPV[4]。目前，臨床上用于宮頸癌篩查的主要手段是宮頸液基薄層細胞學檢查(thinprep cytologic test，TCT)聯合HR-HPV DNA檢測，但這兩種方法反映的僅是宮頸當前的病理狀態，并不能預測宮頸病變的進展及回退。因此，尋找篩查高危宮頸病變的新的生物標志已成為一個研究熱點。近期研究[5]顯示HPV-16 L1有望成為分流HPV感染患者的良好的生物標志物。此外，高危型HPV癌基因E6和E7的表達對于惡性腫瘤的轉化和維持起著重要作用，監測HPV E6/E7 mRNA的表達具有非常重要的意義[6]。該研究通過收集細胞學檢查后剩余液基標本，分別采用甲基化敏感性高分辨溶解曲線法(methylation-sensitive high resolution melting，MS-HRM)檢測HPV-16陽性患者HPV-16 L1甲基化水平，QUANTIVIRUS@HPV E6/E7 mRNA 3.0 Assay(b-DNA)法檢測HPV E6/E7 mRNA的水平，評估這兩個指標在檢測宮頸病變中的臨床價值。

1對象與方法

1.1研究對象選取2012年1月至2013年5月在鄭州大學第三附屬醫院行常規TCT檢查、經PCR分型檢測確認為單純HPV-16陽性且經隨訪陰道鏡檢查獲得組織活檢結果的患者50例，其中CIN1組11例，CIN2組11例，CIN3組21例，宮頸鱗癌(SCC)組7例；另取11例宮頸檢查HPV-16陰性或慢性炎癥者為對照。納入研究的61例患者年齡25～76歲，中位年齡39歲。該研究獲得了鄭州大學第三附屬醫院生命科學倫理委員會批準。

1.2HPV-16 L1甲基化檢測

1.2.1甲基化標準品的配制HPV-16 L1基因 100%甲基化標準和0%甲基化標準均根據目標序列合成，并克隆到E.coli(南京金思特科技有限公司)，兩個標準品DNA濃度均由熒光定量PCR精確定量后，用0%甲基化標準品將100%甲基化標準品分別按比例稀釋，配制成1%、10%、25%、50%和75% 5個甲基化程度的標準品，與0%、100%共計7個標準品，用于隨后的MS-HRM檢測。

1.2.2DNA提取和重亞硫酸鹽修飾將TCT剩余標本4 000 r/min離心5 min，取適量沉淀物加入20 μL蛋白酶K，56 ℃水浴箱中過夜處理。提取的DNA經NanoDrop-2000超微量分光光度計(美國熱電公司)定量檢測后，取900 ng用于重亞硫酸鹽修飾，EpiTect Bisulfite試劑盒購自德國Qiagen公司，操作嚴格按照說明書進行。所有修飾后的DNA及剩余TCT標本分別存放于-80 ℃和4 ℃冰箱。

1.2.3HPV-16 L1基因甲基化狀態檢測采用MS-HRM法。所測HPV-16 L1基因區域為nt5576～5636(NCBI 登記號：NC_001526.2)，相應特異甲基化PCR上游引物序列為5’-GCGCATTATTGTTGAT GTAGGTGATTTTTATTTATATTTTAG-3’，下游引物序列為5’-GCCGCACTAAACAACCAAAAAAACATC TAAAAAAAAATA-3’。PCR擴增體系：5.0 μL 2×EpiTect HRM PCR Master Mix，上、下游引物(10 mg/L)各0.6 μL，1.0 μL修飾后DNA，2.8 μL無菌水。PCR擴增條件：95 ℃ 1 min；95 ℃ 30 s, 退火從60 ℃到52 ℃ 30 s(每個循環下降 0.2 ℃),72 ℃ 30 s,40個循環；72 ℃ 1 min。PCR產物經18 g/L凝膠電泳驗證。擴增后，在LightCycler480上進行高分辨溶解曲線分析，條件為：95 ℃ 1 min, 40 ℃ 1 min, 65 ℃ 1 s, 以0.02 ℃/s的速度從72 ℃上升至95 ℃，收集溶解曲線數據，每1 ℃采集熒光25次，40 ℃ 冷卻1 min。所有標本和標準品同時檢測。最后，運行gene scanning程序，根據樣本與標準品溶解曲線熒光值高低判斷樣本甲基化程度。以10%甲基化為臨界點判定甲基化陽性率。

1.3HPV E6/E7 mRNA檢測試劑盒購自科迪亞生物技術有限公司。采用bDNA法定量檢測標本中HPV E6/E7 mRNA水平，具體按文獻[7]操作：將TCT剩余標本3 000 r/min離心5 min后棄去上清，用2 mL去離子水洗滌后再次離心，棄上清，加入裂解液，放65 ℃恒溫箱過夜；經配制檢測緩沖液、布板、信號放大，上冷光儀檢測，得標本、空白及陽性質控的發光值，用相關光單位(RLU)表示，將所得數據導入專用軟件處理。當標本RLU和陽性質控的cutoff值≥1.00時，判定標本為陽性。

1.4統計學處理采用SPSS 17.0處理數據。宮頸病變級別與HPV-16 L1甲基化程度和HPV E6/E7 mRNA水平間，以及HPV-16 L1甲基化程度與HPV E6/E7 mRNA水平間的相關性采用Spearman秩相關分析，采用χ2檢驗比較不同級別宮頸病變組織中HPV-16 L1甲基化陽性率和HPV E6/E7 mRNA陽性率的差異。檢驗水準α=0.05。

2結果

2.1不同級別宮頸病變組織中HPV-16 L1甲基化程度和HPV E6/E7 mRNA水平的比較所有標準品HPV-16 L1甲基化程度均被成功檢測(圖1)。HPV-16 L1甲基化程度隨宮頸病變嚴重程度的增加而升高(rS=0.638,P<0.001)。HPV E6/E7 mRNA的水平隨宮頸病變嚴重程度的增加而升高(rS=0.525,P<0.001)。

圖1　MS-HRM方法檢測HPV-16 L1不同甲基化程度標準品和標本的差異標準曲線圖

2.2宮頸病變組織中HPV-16 L1甲基化程度與HPV E6/E7 mRNA水平間的關系HPV-16 L1甲基化程度與HPV E6/E7 mRNA水平呈正相關(rS=0.420,P=0.001)。

2.3不同宮頸病變HPV-16 L1甲基化陽性率和HPV E6/E7 mRNA陽性率比較見表1。

表1　不同宮頸病變HPV-16 L1甲基化

*：與對照組相比，P<0.005。

2.4不同檢測方法診斷CIN2以上病變的敏感性、特異性、陽性預測值和陰性預測值見表2。

表2　不同檢測方法診斷CIN2以上病變的敏感性、特異性、陽性預測值和陰性預測值　%

3討論

有研究[8-9]指出，HPV DNA 的甲基化狀態可以提示HPV感染者CIN2及以上瘤變。HR-HPV感染是宮頸癌發生的重要始動因素。在全球范圍內，HPV-16型目前已經證實是宮頸癌中最常見的型別；HPV-16致癌性最強，且從最初感染到進展為宮頸癌的發病時間也相對其他類型的HR-HPV要短很多。HPV-16 L1殼蛋白具有較強的免疫原性，可誘導先天性或獲得性免疫應答，有利于機體清除感染細胞。HPV-16 L1基因甲基化則在一定程度上可能影響L1殼蛋白的表達，使得其免疫效應弱化，最終導致宮頸疾病的發生和進展。因此，HPV-16 L1甲基化有望成為分流HPV感染患者的良好生物標志物。

近年來，人們對DNA甲基化認識不斷提高，并研究開發了一系列檢測DNA甲基化的方法。HPV基因組長7 000～8 000 bp，由于其基因組中沒有典型的CpG島，所以目前多采用特異位點甲基化的檢測手段，就方法學而言各有其特點[10]。與其他方法相比，MS-HRM方法具有以下優點：①能夠定量檢測DNA甲基化程度。②高通量且能夠減少工作量。③節約成本。④快速且敏感性高。作者選擇MS-HRM作為檢測方法，結果顯示，HPV-16 L1甲基化程度隨宮頸病變嚴重程度的增加呈上升的趨勢，且CIN2以上病變組HPV-16 L1甲基化陽性率高于對照組，和以往研究[11]結果一致。

HPV的早期基因E6/E7編碼的早期蛋白在宿主細胞中表達是導致宮頸癌的關鍵因素[12]，其機制可能為E6/E7蛋白抑制了抑癌基因p53和pRB[13-14]，引起細胞過度增殖，最終導致宮頸癌的發生[15]。因此，作為E6/E7蛋白翻譯模板的mRNA的檢測有利于區別短暫性HPV感染和高級別宮頸病變相關的HPV感染，較之DNA 檢測特異性更高，也更具有臨床指導意義[16]。

該研究采用的bDNA技術是一種三明治結構的核酸雜交方法。該方法采用bDNA分子放大捕獲的目標RNA信號。該技術特點是檢測樣本不需呈指數增長的擴增過程，通過支鏈DNA和化學發光兩種信號放大技術達到檢測微量樣本的能力，克服了傳統的實時PCR技術中操作復雜、易污染的弊端。該研究結果顯示，HPV E6/E7 mRNA的水平隨宮頸病變級別的升高而升高，且CIN3以上病變組HPV E6/E7 mRNA的陽性率高于對照組，與上述理論及作者以往的研究[17]一致，也與有關研究[18-19]結果相似。

此外，該研究結果還顯示：HPV-16 L1甲基化程度與HPV-16 E6/E7 mRNA水平呈正相關；在對CIN2以上病變檢測時，兩種方法及兩種方法聯合檢測的敏感性、特異性、陽性預測值和陰性預測值間無明顯差異，說明兩種方法及兩種方法聯合對宮頸病變診斷具有相同作用。

綜上所述，HPV-16 L1甲基化與HPV E6/E7 mRNA與宮頸癌病變關系密切，在分流HPV感染患者方面應具有良好的臨床應用前景。HPV-16 L1甲基化檢測或HPV E6/E7 mRNA檢測可與HPV DNA檢測互為補充，為婦科醫師臨床診治HPV感染患者及評估臨床療效提供依據。

參考文獻

[1]JEMAL A,BRAY F,CENTER MM,et al.Global cancer statistics[J].CA Cancer J Clin,2011,61(2):69

[2]胡濱,崔金全,鄧克紅,等.宮頸癌組織高危型HPV感染與HWAPL蛋白表達的關系[J].鄭州大學學報(醫學版),2014,49(6):862

[3]吳余,崔靜,王虹,等.HPV16相關宮頸癌組織中MUC16和E6表達的關系[J].鄭州大學學報(醫學版),2015,50(1):41

[4]LI N,FRANCESCHI S,HOWELL-JONES R,et al.Human papillomavirus type distribution in 30,848 invasive cervical cancers worldwide:variation by geographical region, histological type and year of publication[J].Int J Cancer,2011,128(4):927

[5]BRYANT D,ONIONS T,RAYBOULD R,et al.Increased methylation of human papillomavirus type 16 DNA correlates with viral integration in vulval intraepithelial neoplasia[J].J Clin Virol,2014,61(3):393

[6]SPATHIS A，KOTTARIDI C,CHRANIOTI A,et al.mRNA and DNA detection of human papillomaviruses in women of all ages attending two colposcopy clinics[J].PLoS One,2012,7(11):e49205

[7]沈勇.HPV E6/E7 mRNA對宮頸癌的診斷價值[D].鄭州:鄭州大學,2013.

[8]SNELLENBERG S,SCHUTZE DM,CLAASSEN-KRAMER D,et al.Methylation status of the E2 binding sites of HPV16 in cervical lesions determined with the Luminex?xMAPTMsystem[J].Virology,2012,422(2):357

[9]SUN C,REIMERS LL,BURK RD.Methylation of HPV16 genome CpG sites is associated with cervix precancer and cancer[J].Gynecol Oncol,2011,121(1):59

[10]李懿,李光潤,陳宏.DNA甲基化檢測技術進展及經驗總結[J].醫學綜述,2015,21(2):204

[11]CLARKE MA,WENTZENSEN N,MIRABELLO L,et al.Human papillomavirus DNA methylation as a potential biomarker for cervical cancer[J].Cancer Epidemiol Biomarkers Prev,2012,21(12):2125

[12]LI J,LI LK,MA JF,et al.Knowledge and attitudes about human papillomavirus(HPV) and HPV vaccines among women living in metropolitan and rural regions of China[J].Vaccine,2009,27(8):1210

[13]VOUSDEN K.Interactions of human papillomavirus transforming proteins with the products of tumor suppressor genes[J].FASEB J,1993,7(10):872

[14]LIVINGSTONE LR,WHITE A,SPROUSE J,et al.Altered cell cycle arrest and gene amplification potential accompany loss of wild-type p53[J].Cell,1992,70(6):923

[15]SHAIKH F,SANEHI P,RAWAL R.Molecular screening of compounds to the predicted protein-protein interaction site of Rb1-E7 with p53-E6 in HPV[J].Bioinformation,2012,8(13):607

[16]CUZICK J,MAYRAND MH,RONCO G,et al.Chapter 10:new dimensions in cervical cancer screening[J].Vaccine,2006,24(Suppl 3):90

[17]智艷芳,李肖甫,沈勇,等.人乳頭瘤病毒癌基因E6/E7 mRNA檢測在宮頸病變中的臨床意義[J].國際遺傳學雜志,2014,37(1):7

[18]姜俊,陳宜剛,王華,等.人乳頭瘤病毒E6/E7 mRNA的檢測在宮頸癌篩查中的初步評價[J].南京醫科大學學報(自然科學版),2013,9(9):1261

[19]KOTTARIDI C,TSIODRAS S,SPATHIS A,et al.Clinical performance of human papillomavirus E6, E7 mRNA flow cytometric assay compared to human papillomavirus DNA typing[J].Anal Quant Cytol Histol,2011,33(6):305

(2015-04-22收稿責任編輯徐春燕)

*河南省科技廳基礎科技攻關課題資助項目122300410036

Clinical value of HPV-16 L1 methylation and HPV E6/E7 mRNA testing in detection of cervical lesions

LIXiaofu，QIUCui，ZHIYanfang，LIYa，RONGShouhua，FANTingting

DepartmentofCytopathology,theThirdAffiliatedHospital，ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

Key wordshuman papillomavirus;cervical lesion;HPV-16 L1 methylation;HPV E6/E7 mRNA

中圖分類號R737.3

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.01.012