胃癌患者癌組織膜聯蛋白A2的表達與血清膜聯蛋白A2及癌胚抗原水平測定*

張志棟，李　勇，檀碧波，趙　群，焦志凱，趙雪峰，王　冬，劉　羽

河北醫科大學第四醫院外三科 石家莊 050011

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胃癌患者癌組織膜聯蛋白A2的表達與血清膜聯蛋白A2及癌胚抗原水平測定*

張志棟，李勇#，檀碧波，趙群，焦志凱，趙雪峰，王冬，劉羽

河北醫科大學第四醫院外三科 石家莊 050011

關鍵詞胃腫瘤;膜聯蛋白A2;癌胚抗原

摘要目的：檢測胃癌患者癌組織中膜聯蛋白A2(ANXA2)的表達和血清ANXA2及癌胚抗原(CEA)水平，并分析其臨床意義。方法：選取胃癌患者65例(淋巴結陰性16例、淋巴結陽性不伴遠處轉移40例、淋巴結陽性伴遠處轉移9例)為觀察組，同時選取50名健康體檢者為對照組。采用免疫組化SP法檢測觀察組患者癌及癌旁組織中ANXA2的表達。取觀察組患者術前1 d、術后1個月及對照組血清，采用ELISA法檢測ANXA2水平，采用電化學發光法檢測血清CEA水平。結果：觀察組患者癌組織中ANXA2的陽性表達率高于癌旁組織(P<0.001)；淋巴結陽性不伴遠處轉移者、淋巴結陽性伴遠處轉移者癌組織中ANXA2的陽性表達率高于淋巴結陰性者(P<0.017)。觀察組術前血清ANXA2、CEA水平高于對照組，觀察組中淋巴結陽性伴遠處轉移者血清CEA水平最高(P<0.05)；術后1個月觀察組血清ANXA2、CEA水平較術前降低，與對照組差異無統計學意義(P>0.05)。觀察組癌組織中ANXA2的陽性表達率與術前血清ANXA2水平呈正相關，術前血清ANXA2與CEA水平也呈正相關(rS=0.407和0.537，P均<0.001)。結論：聯合檢測血清ANXA2與CEA對胃癌的病情評估有重要意義。

AbstractAim: To test the expression of ANXA2 in gastric cancer tissue and ANXA2 and carcinoembryonic antigen(CEA) in serum from patients with gastric cancer.Methods: A total of 65 cases of gastric cancer were recruited as observation group(16 with negative lymph nodes, 40 with positive lymph nodes but without distant metastasis, 9 with positive lymph nodes and distant metastasis), and 50 normal healthy individuals, as control group.Immunohistochemical SP technique was performed to detect the expression of ANXA2 in gastric cancer and normal mucosa tissue.The serum of the observation group was prepared before and after operation, the level of ANXA2 was tested by ELISA, and the level of CEA was tested with electrochemiluminescence immunoassay.Results: The positive expression rate of ANXA2 was higher in gastric cancer tissue than that in normal mucosa tissue(P<0.001), and the expression of ANXA2 in the patients with positive lymph nodes and distant metastasis and the patients with positive lymph nodes but without distant metastasis was higher than that of patients with negative lymph nodes(P<0.017). The levels of preoperative ANXA2 and CEA in serum of observation group were higher than those of control group, and the highest serum CEA level was found in positive lymph nodes with distant metastasis patients(P<0.05). After operation, the levels of serum ANXA2 and CEA of observation group decreased significantly,which had no significant difference with control group(P>0.05). Positive correlation was found between the expression of ANXA2 in tumor tissue and serum level of ANXA2 in observation group(rS=0.407,P<0.001). Positive correlation was found between serum ANXA2 and CEA(rS=0.537,P<0.001).Conclusion: It′s of important significance by testing serum ANXA2 combined with CEA for evaluating the gastric cancer patients′ condition.

胃癌是我國最常見的消化道惡性腫瘤，由于缺乏特異性癥狀，早期診斷者不足10%[1]。多數患者就診時病變已屬進展期，多伴有淋巴結轉移甚至遠處轉移，綜合治療效果不理想，預后較差。目前已將腫瘤標志物用于胃癌的診斷和病情監測，如癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)、CA125、CA199等，但特異性、準確性都不能令人滿意。為了更好地評估胃癌患者的嚴重程度、病情發展及預測腫瘤的復發，尋找新的腫瘤標志物意義重大。膜聯蛋白A(annexins A，ANXA)家族是一類廣泛存在于真核細胞的鈣磷脂結合蛋白，作用廣泛。ANXA2是其中的重要成員，參與人類細胞的生理活動，且與惡性腫瘤的發生發展關系密切。有研究[2-4]表明ANXA2與乳腺癌、肝癌、膽管癌等關系密切，且與腫瘤的大小、病情的嚴重程度、腫瘤的分化程度及轉移有關。作者所在的課題組前期研究[5]也發現ANXA2與胃癌關系密切，但是ANXA2在胃癌患者血清中的水平及其意義尚不清楚。該研究通過檢測胃癌患者血清及癌組織中ANXA2的表達情況以及血清中CEA水平，進一步探討其臨床意義，為胃癌發病機制及新型腫瘤標志物的探索提供依據。

1對象與方法

1.1研究對象選取2013年2月至2014年6月于河北醫科大學第四醫院行手術治療的胃癌患者65例為觀察組，其中淋巴結陰性16例、淋巴結陽性不伴遠處轉移40例、淋巴結陽性伴遠處轉移9例，均經術后病理證實；男35例，女30例，年齡28～66歲。同時選取性別、年齡匹配的健康體檢者50人(男28人，女22人)為對照組，年齡27～66歲。所有入組者均知情同意。

1.2主要試劑及儀器ELISA試劑盒購自美國R﹠D公司。ANXA2兔抗人多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司，SP免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。全自動電化學發光免疫分析儀(羅氏E601)，酶免之星全自動免疫分析儀(瑞士Hamilton公司產品)。

1.3不同組織中ANXA2蛋白表達的檢測癌組織石蠟標本在連續4 μm切片后用于檢測ANXA2的表達，并以來自手術或胃鏡活檢、證實為無癌及不典型增生組織的癌旁黏膜組織為對照。石蠟切片脫蠟水化后依免疫組化SP法染色試劑盒說明書進行操作。一抗按1400稀釋。用已知陽性組織切片作為陽性對照，以PBS代替一抗為陰性對照。根據陽性細胞百分比和染色強度綜合評分，在高倍鏡下選10個視野，無陽性細胞計0分，陽性細胞百分比<25%計1分，25%～計2分，51%～計3分，>75%計4分；未著色0分，淡黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分。兩種計分標準所得分值的乘積為0或1為陰性，≥2為陽性。

1.4血清ANXA2及CEA水平的檢測觀察組在術前1 d、術后1個月各采血1次，對照組采血1次。采用ELISA法檢測ANXA2。室溫靜置30 min后，3 500 r/min離心15 min，分離血清。嚴格依據試劑盒說明書操作。100 μL血清樣本或者標準品被分別添加到96孔板中，加入A試劑100 μL，37 ℃孵育60 min，再加入B試劑100 μL，37 ℃孵育30 min，然后加入底物溶液90 μL，37 ℃孵育25 min，最后每孔添加終止液50 μL，并讀取450 nm 處的吸光度。板內、板間變異系數均<10%，全自動酶標儀讀數。采用電化學發光法檢測血清CEA水平。

1.5統計學處理采用SPSS 16.0處理數據。胃癌患者癌和癌旁組織ANXA2陽性表達率的比較采用配對χ2檢驗，不同病理階段的胃癌組織間ANXA2陽性表達率的比較采用χ2檢驗；觀察組手術前后和對照組血清ANXA2、CEA水平的比較采用兩獨立樣本的t檢驗，不同病理階段的胃癌患者血清ANXA2和CEA水平比較采用重復測量數據的方差分析；用Spearman秩相關系數分析觀察組血清ANXA2水平和癌組織中ANXA2表達的關系以及血清ANXA2 水平和CEA水平的關系。檢驗水準α=0.05。

2結果

2.1胃癌與癌旁組織ANXA2的表達情況見圖1、表1。不同胃癌組織中ANXA2的表達見表2。由表1、2可知，觀察組癌組織中ANXA2陽性表達率為81.5%(53/65)，高于癌旁胃黏膜組織的陽性率[4.6%(3/65)]；淋巴結陽性不伴遠處轉移組、淋巴結陽性伴遠處轉移組癌組織中ANXA2的陽性表達率高于淋巴結陰性組。

圖1　癌旁胃黏膜(A)和胃癌(B)組織中ANXA2的表達(SP，×400)

表1　胃癌與癌旁胃黏膜組織中ANXA2的表達　例

表2　不同胃癌組織中ANXA2的表達　例(%)

χ2=5.979，P=0.015；*：與淋巴結陰性組相比，P<0.017。

2.2各組血清ANXA2、CEA水平的比較見表3～5。由表3～5可知，觀察組術前血清ANXA2及CEA水平高于對照組，觀察組術后1個月血清ANXA2及CEA水平與對照組相比，差異無統計學意義。觀察組中，淋巴結陽性伴遠處轉移者術前血清CEA水平最高。

表3　觀察組手術前后和

表4　不同病理階段的

F組間=3.141，P=0.050；F時間=272.558，P<0.001；F交互=2.790，P=0.069。

表5　不同病理階段的

F組間=16.441，P<0.001；F時間=1 556.522，P<0.001；F交互=12.568，P<0.001。

2.3觀察組術前血清ANXA2水平與癌組織中ANXA2陽性表達率及術前血清CEA水平的關系觀察組術前血清ANXA2水平與癌組織中ANXA2的陽性表達率呈正相關(rS=0.407，P<0.001)；觀察組術前血清ANXA2水平與術前CEA水平呈正相關(rS=0.537，P<0.001)。

3討論

胃癌在我國常見的消化道惡性腫瘤中發病率、死亡率均居首位，嚴重危害國人健康[6]。由于目前胃癌腫瘤標志物用作胃癌診斷和病情監測的準確率不能令人滿意，故尋找新的腫瘤標志物對胃癌病情評估及綜合治療意義重大[7]。ANXA2與包括胃癌在內的多種惡性腫瘤關系密切，但該指標能否作為胃癌標志物報道很少。ANXA2全長14 000 bp，編碼339個氨基酸，定位于人染色體15q21-q22，由13個外顯子和12個內含子組成。ANXA2廣泛表達于內皮細胞、單核細胞、神經細胞等的胞核和胞質中，參與細胞的增殖、分化、凋亡等生命過程[8]，并與腫瘤關系密切。Yonglitthipagon等[4]的研究表明，ANXA2在膽管癌中的高表達是預后差的指標；Yang等[9]研究發現ANXA2表達增高是結直腸癌預后差的獨立影響因素。Wang等[10]研究發現抑制ANXA2表達后，肝癌細胞的生長受到抑制，且可以提高肝癌細胞對氟尿嘧啶的敏感性。該研究發現ANXA2在胃癌組織中的表達高于癌旁胃黏膜組織，與其他報道[11]一致。同時作者還發現，淋巴結陽性伴及不伴遠處轉移的患者癌組織中ANXA2的陽性表達率高于淋巴結陰性的患者，提示ANXA2對胃癌的惡化與轉移可能有促進作用。

為探討ANXA2作為胃癌標志物的可行性，作者同時應用ELISA技術檢測了胃癌患者血清ANXA2的水平。結果顯示胃癌患者術前血清ANXA2高于正常人，而手術切除腫瘤后ANXA2水平降至正常水平，說明血清ANXA2對反映體內腫瘤狀態有意義。對胃癌患者的血清ANXA2深入分析還發現，淋巴結陽性伴遠處轉移組、淋巴結陽性不伴遠處轉移組及淋巴結陰性組血清ANXA2雖呈下降趨勢，但差異無統計學意義(P=0.069)，應擴大樣本量進一步驗證。相關分析表明觀察組血清ANXA2水平與癌組織中ANXA2的陽性表達率呈正相關，提示血清ANXA2檢測可作為胃癌術前分期的參考指標。術后血清ANXA2明顯降低，也證實ANXA2在血清的水平與體內腫瘤的狀態有關，術后監測血清ANXA2可反映體內腫瘤復發轉移情況。

CEA是目前最常用的胃癌標志物[12]，對胃癌復發轉移監測有意義。該研究結果發現，血清CEA水平與ANXA2水平呈正相關，提示血清ANXA2和CEA檢測可能對預測胃癌復發轉移有協同作用。

總之，該研究發現，ANXA2在胃癌患者的血清和癌組織中均存在升高的現象且存在相關性；監測血清ANXA2和CEA水平對預測胃癌病情有重要意義。但該研究規模較小，未進行深入的機制分析，這些問題還需要進一步研究完善。

參考文獻

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(2015-03-27收稿責任編輯徐春燕)

*河北省普通高校強勢特色學科資助項目冀教高[2005]52;河北省衛生和計劃生育委員會課題ZD20140442

Detection of expression of ANXA2 in gastric cancer tissue and serum ANXA2 and CEA levels

ZHANGZhidong，LIYong，TANBibo，ZHAOQun，JIAOZhikai，ZHAOXuefeng，WANGDong，LIUYu

TheThirdDepartmentofSurgery，theFourthAffiliatedHospital，HebeiMedicalUniversity，Shijiazhuang050011

Key wordsgastric neoplasm;annexins A2;carcinoembryonic antigen

中圖分類號R735.2

通信作者#，男，1958年10月生，博士，教授，主任醫師，研究方向：消化道惡性腫瘤基礎與臨床，E-mail:liyonghbth@126.com

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.01.019