沉默MACC1的表達(dá)對(duì)卵巢癌細(xì)胞系SKOV-3順鉑化療敏感性的影響*

李　霞，史惠蓉，鄧佑興，張瑞濤

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科；河南省高等學(xué)校臨床醫(yī)學(xué)重點(diǎn)學(xué)科開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室 鄭州 450052

?

沉默MACC1的表達(dá)對(duì)卵巢癌細(xì)胞系SKOV-3順鉑化療敏感性的影響*

李霞，史惠蓉#，鄧佑興，張瑞濤

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科；河南省高等學(xué)校臨床醫(yī)學(xué)重點(diǎn)學(xué)科開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室 鄭州 450052

關(guān)鍵詞結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)因子1；RNA干擾；順鉑敏感性；卵巢癌；SKOV-3細(xì)胞

摘要目的：探討沉默結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因1(MACC1)對(duì)卵巢癌上皮性癌細(xì)胞SKOV-3順鉑化療敏感性的影響。方法：SKOV-3細(xì)胞分為shRNA轉(zhuǎn)染組(重組質(zhì)粒psuper-EGFP-s3轉(zhuǎn)染)、空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組(psuper-EGFP-neo轉(zhuǎn)染)和對(duì)照組(未作轉(zhuǎn)染)，采用RT-PCR法和Western blot法檢測(cè)各組細(xì)胞MACC1 mRNA和蛋白的表達(dá)，MTT法檢測(cè)細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥性。結(jié)果：3組SKOV-3細(xì)胞MACC1 mRNA和蛋白表達(dá)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，shRNA轉(zhuǎn)染組較未轉(zhuǎn)染組和空質(zhì)粒組下降。shRNA轉(zhuǎn)染組對(duì)順鉑的IC50較對(duì)照組和空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組下降(P<0.05)。結(jié)論：沉默MACC1的表達(dá)能增加卵巢癌SKOV-3細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性。

AbstractAim: To investigate the relationship of RNA interfering MACC1 and cisplatin sensibility of ovarian cancer cell line SKOV-3.Methods: SKOV-3 cells were divided into 3 groups:shRNA group(recombinant plasmid psuper-EGFP-s3 transfected SKOV-3 cells), empty plasmid transfection group(psuper-EGFP-neo transfected SKOV-3 cells) and control group (non transfected SKOV-3 cells). RT-PCR and Western blot were used to detect the expressions of MACC1 mRNA and protein. IC50of cisplatin in different groups was determined by MTT assay.Results: The expressions of MACC1 mRNA and protein in the 3 groups were significantly different(P<0.05), and those of the shRNA transfection group were lower than those in the control group and empty plasmid group. The shRNA transfection group had lower IC50than the control group and empty plasmid group(P<0.05).Conclusion: The sensitivity of SKOV-3 cells to cisplatin could be enhanced by RNA interfering MACC1 gene.

卵巢癌是病死率最高的婦科惡性腫瘤，患者對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥是限制其臨床療效的主要原因之一。結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因1(metastasis-associated in colon cancer 1,MACC1)是Stein等[1]于2009年通過(guò)全基因表達(dá)分析在結(jié)腸癌原發(fā)和轉(zhuǎn)移灶中發(fā)現(xiàn)的一個(gè)與結(jié)腸癌密切相關(guān)的基因。MACC1在胃癌[2]、肺癌[3]、肝細(xì)胞癌[4]、胰腺癌[5]和卵巢癌[6]組織中高表達(dá)可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，可作為評(píng)價(jià)其預(yù)后和轉(zhuǎn)歸的腫瘤標(biāo)志物。該研究應(yīng)用真核質(zhì)粒載體介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù)抑制MACC1基因的表達(dá)，探討MACC1基因沉默后對(duì)卵巢癌細(xì)胞SKOV-3順鉑敏感性的影響。

1材料與方法

1.1主要試劑靶向MACC1基因的重組shRNA質(zhì)粒psuper-EGFP-MACC1和空質(zhì)粒psuper-EGFP-neo由鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建；感受態(tài)大腸桿菌DH5α、人卵巢癌敏感細(xì)胞株SKOV-3由鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科實(shí)驗(yàn)室保存。RPMI 1640培養(yǎng)液購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；胎牛血清購(gòu)自南美Thermo Scientific Hyclone公司；質(zhì)粒小量提取試劑盒購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；兔抗人MACC1多克隆抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；羊抗兔單克隆IgG抗體購(gòu)自美國(guó)LifeSpan BioSciences 公司；兔抗人β-actin單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司；MTT購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京凱基生物科技有限公司；增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(ECL)顯色試劑盒購(gòu)自美國(guó)Advansta公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)SKOV-3細(xì)胞在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2條件下，常規(guī)培養(yǎng)于含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中。

1.3細(xì)胞分組、轉(zhuǎn)染和篩選轉(zhuǎn)染前24 h，將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的SKOV-3細(xì)胞按1.5×105/孔接種于24孔板，37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2條件下恒溫培養(yǎng)。次日待細(xì)胞70%～80%融合時(shí)，將細(xì)胞分為shRNA轉(zhuǎn)染組(重組質(zhì)粒psuper-EGFP-s3轉(zhuǎn)染SKOV-3細(xì)胞)、空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組(super-EGFP-neo轉(zhuǎn)染細(xì)胞)和對(duì)照組(未轉(zhuǎn)染的SKOV-3細(xì)胞)，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。具體轉(zhuǎn)染步驟嚴(yán)格按照轉(zhuǎn)染說(shuō)明書(shū)進(jìn)行, 用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的無(wú)抗生素RPMI 1640培養(yǎng)液將G418溶液稀釋至800 mmol/L，篩選3周，然后用含體積分?jǐn)?shù)15%小牛血清的400 mmol/L G418無(wú)抗生素RPMI 1640培養(yǎng)液維持培養(yǎng)30 d，挑選細(xì)胞克隆集落。

1.4RT-PCR技術(shù)檢測(cè)MACC1 mRNA的表達(dá)收集轉(zhuǎn)染48 h后的SKOV-3細(xì)胞和未轉(zhuǎn)染的SKOV-3細(xì)胞，按Trizol Reagent說(shuō)明書(shū)的要求提取各組細(xì)胞的總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)將mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。MACC1基因的上游引物5’-CCT TCGTGGTAATAATGCTTCC-3’，下游引物5’-AGGGCTTCCATTGTATTGAGGT-3’；以磷酸甘油醛脫氫(GAPDH)為內(nèi)參照，上游引物5’-TGAACGG GAAGCTCACTGG-3’，下游引物5’-TCCACCACCCT GTTGCTGTA-3’；引物由上海生工生物工程有限公司合成。反應(yīng)條件：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s,72 ℃ 2 min,35個(gè)循環(huán)；94 ℃ 延伸4 min, 4 ℃保存。以MACC1/GAPDH比值表示MACC1 mRNA的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5Western blot 檢測(cè)MACC1蛋白的表達(dá)取3組細(xì)胞均勻種植于6孔板中，待細(xì)胞30%～ 50%融合，用Bio-Rad 蛋白測(cè)定試劑盒測(cè)定上清中蛋白濃度，并據(jù)此調(diào)整上樣量，保持上樣量一致。配制二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，其中分離膠濃度120 g/L、濃縮膠濃度50 g/L。恒壓120 V 電泳，恒壓45V、90 min轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜。50 g/L脫脂奶粉封閉轉(zhuǎn)印膜2 h，500倍稀釋的兔抗人MACC1 單克隆抗體孵育過(guò)夜。用TBS緩沖液低速搖床漂洗2次，每次10 min，然后放入TBST溶液中漂洗10 min。再加入1 000倍稀釋的鼠抗兔IgG，常溫孵育2 h，TBS溶液洗滌2次，每次10 min，最后放入TBST中漂洗10 min。于凝膠成像系統(tǒng)利用ECL化學(xué)發(fā)光試劑曝光，保存圖片。以β-actin作為內(nèi)參，應(yīng)用Quantity One 軟件對(duì)各條帶進(jìn)行灰度分析, 計(jì)算MACC1/β-actin比值表示MACC1蛋白的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.6MTT法檢測(cè)SKOV-3細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥性取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SKOV-3細(xì)胞，用2.5 g/L的胰蛋白酶消化，制成單細(xì)胞懸液，按2×103mL-1接種于96孔板中，置37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后加入終濃度0.000、3.125、6.250、12.500、25.000、50.000 μmol/L的順鉑，每濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔。孵育3 h后更換成完全培養(yǎng)基。72 h后每孔加入 5 g/L MTT 20 μL，37 ℃繼續(xù)孵育4 h后小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)基，每孔加入DMSO 150 μL，置于搖床上低速振蕩10 min，酶標(biāo)儀測(cè)量490 nm波長(zhǎng)處的吸光度(A)值。細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率=(對(duì)照組A值-各濃度組A值)/對(duì)照組A值×100%，并繪制藥物-劑量反應(yīng)曲線，以Bliss法計(jì)算半數(shù)抑制濃度(IC50)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 13. 0進(jìn)行分析，各組細(xì)胞MACC1 mRNA和蛋白的表達(dá)差異、對(duì)順鉑的IC50值的比較采用單因素方差分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2結(jié)果

2.1各組SKOV-3細(xì)胞MACC1的mRNA和蛋白表達(dá)見(jiàn)表1和圖1、2。

M：Marker；1：shRNA轉(zhuǎn)染組；2：空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組；3：對(duì)照組。圖1　各組細(xì)胞MACC1 mRNA表達(dá)的RT-PCR法檢測(cè)結(jié)果

1：對(duì)照組；2：空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組；3：shRNA轉(zhuǎn)染組。圖2　各組細(xì)胞MACC1蛋白表達(dá)的Western blot檢測(cè)結(jié)果

組別nmRNA蛋白對(duì)照組31.00±0.001.00±0.00空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組31.06±0.051.07±0.08shRNA轉(zhuǎn)染組30.88±0.02*0.79±0.03*F11.12010.980P0.0230.008

*:與空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組和shRNA轉(zhuǎn)染組比較，P<0.05。

2.2各組SKOV-3細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥情況見(jiàn)表2。

表2　各組SKOV-3細(xì)胞對(duì)順鉑IC50值　μmol/L

F=26.510，P=0.017;*：與其他2組比較，P<0.05。

3討論

卵巢癌作為一種惡性程度極高的腫瘤，發(fā)病率不斷上升，有70%～80%的患者一經(jīng)確診就已屬于晚期[7]。腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)加鉑類(lèi)和紫杉醇為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療已成為當(dāng)前卵巢癌的標(biāo)準(zhǔn)治療手段，然而由于化療耐藥的存在，5 a生存率僅為30%[7]。因此，探討鉑類(lèi)化療耐藥機(jī)制、尋找特異性強(qiáng)且患者可耐受的治療卵巢癌的有效方法是當(dāng)前的腫瘤研究熱點(diǎn)之一。順鉑耐藥性產(chǎn)生的確切機(jī)制尚不明確，以糖蛋白P-gp、耐藥相關(guān)蛋白、拓?fù)洚悩?gòu)酶、蛋白激酶C的活性、細(xì)胞解毒功能及DNA損傷修復(fù)能力等分子[8]作為靶點(diǎn)的耐藥逆轉(zhuǎn)研究目前仍存在許多難以克服的問(wèn)題，因此尋找新的耐藥分子靶點(diǎn)仍是當(dāng)前研究的重點(diǎn)。

RNAi是一種新興的基因干擾技術(shù)，已經(jīng)用于惡性腫瘤化療耐藥及逆轉(zhuǎn)方面的研究，并成為探索基因功能和耐藥關(guān)系等領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)[9]。Wang等[5]發(fā)現(xiàn)MACC1在胰腺癌患者血清中呈高表達(dá)，且隨著淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移和腫瘤病理分期的提高而顯著升高，可作為胰腺癌輔助診斷的有用標(biāo)志物之一；且下調(diào)MACC1的表達(dá)增加了胰腺癌細(xì)胞系CFPAC-1對(duì)吉他西濱的化療敏感性。

作者前期研究[6,10]結(jié)果顯示MACC1的異常可能協(xié)同HGF和C-met參與了卵巢癌的惡性進(jìn)展。作者還成功構(gòu)建了MACC1特異性shRNA真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染后獲得穩(wěn)定表達(dá)該組載體的卵巢癌SKOV-3細(xì)胞株。該研究結(jié)果表明，將靶向MACC1基因的重組質(zhì)粒導(dǎo)入卵巢癌SKOV-3細(xì)胞，細(xì)胞中MACC1的mRNA和蛋白水平均下降；對(duì)順鉑的IC50較對(duì)照和空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞下降。在MACC1基因沉默效果最顯著的細(xì)胞株中檢測(cè)到MACC1、C-met和MAPK信號(hào)通路關(guān)鍵活性蛋白的表達(dá)降低，提示MACC1可能通過(guò)HGF/C-met和MAPK信號(hào)通路參與卵巢癌的發(fā)生發(fā)展[11-12]。而MAPK信號(hào)通路在多種惡性腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡和化療耐藥產(chǎn)生過(guò)程中發(fā)揮重要作用，阻斷上述信號(hào)通路后不僅能夠抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，還能逆轉(zhuǎn)惡性腫瘤細(xì)胞的化療耐藥[13-14]。

總之，通過(guò)干擾MACC1在卵巢癌SKOV-3細(xì)胞的表達(dá)，SKOV-3細(xì)胞中MACC1的mRNA和蛋白的表達(dá)下降，細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性明顯增高。由此推測(cè)，MACC1基因可能在卵巢癌順鉑原發(fā)性耐藥中發(fā)揮重要作用。深入研究MACC1基因在順鉑原發(fā)性耐藥中的機(jī)制，有助于加深對(duì)卵巢癌順鉑原發(fā)性耐藥的認(rèn)識(shí)，為指導(dǎo)臨床治療提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

[1]STEIN U,WALTHER W,ARLT F,et al.MACC1,a newly identified key regulator of HGF-MET signaling, predicts colon cancer metastasis[J].Nat Med,2009,15(1):59

[2]SHIRAHATA A,SAKATA M,KITAMURA Y,et al.MACC 1 as a marker for peritoneal-disseminated gastric carcinoma[J].Anticancer Res,2010,30(9):3441

[3]SHIMOKAWA H,URAMOTO H,ONITSUKA T,et al.Overexpression of MACC1 mRNA in lung adenocarcinoma is associated with postoperative recurrence[J].J Thorac Cardiovasc Surg,2011,141(4):895

[4]SHIRAHATA A,FAN W,SAKURABA K,et al.MACC 1 as a marker for vascular invasive hepatocellular carcinoma[J].Anticancer Res,2011,31(3):777

[5]WANG G,KANG MX,LU WJ,et al.MACC1:a potential molecule associated with pancreatic cancer metastasis and chemoresistance[J].Oncol Lett,2012,4(4):783

[6]ZHANG RT,SHI HR,HUANG HL,et al.Expressions of MACC1, HGF, and C-met protein in epithelial ovarian cancer and their significance[J].Nan Fang Yi Ke Da Xue Xue Bao,2011,31(9):1551

[7]曹澤毅.中華婦產(chǎn)科學(xué)[M].2版.北京:人民衛(wèi)生出版社,2004:2153

[8]KELLAND L.The resurgence of platinum-based cancer chemotherapy[J].Nat Rev Cancer,2007,7(8):573

[9]IORNS E,LORD CJ,TURNER N,et al.Utilizing RNA interference to enhance cancer drug discovery[J].Nat Rev Drug Discov.2007,6(7):556

[10]黃好亮,史惠蓉,張瑞濤,等.卵巢上皮性癌組織中結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因1的表達(dá)及其臨床意義[J].腫瘤,2011,30(6):522

[11]張瑞濤,史惠蓉,陳志敏,等.MACC1基因shRNA真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其在OVCAR-3細(xì)胞中的表達(dá)[J].實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志,2011,27(14):2518

[12]ZHANG R,SHI H,CHEN Z,et al.Effects of metastasis-associated in colon cancer 1 inhibition by small hairpin RNA on ovarian carcinoma OVCAR-3 cells[J].J Exp Clin Cancer Res,2011,30:83

[13]NICOSIA SV,BAI W,CHENG JQ,et al.Oncogenic pathways implicated in ovarian epithelial cancer[J].Hematol Oncol Clin North Am,2003,17(4):927

[14]MONTAGUT C,SETTLEMAN J.Targeting the RAF-MEK-ERK pathway in cancer therapy[J].Cancer Lett,2009,283(2):125

*河南省重點(diǎn)科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目122102310545

Effect of silencing MACC1 gene on cisplatin chemosensibility of ovarian cancer cell line SKOV-3

LIXia,SHIHuirong,DENGYouxing,ZHANGRuitao

Key-DisciplinesLaboratoryofClinical-MedicineofHenan;DepartmentofGynecologyandObstetrics,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

Key wordsmetastasis-associated in colon cancer 1；RNA interference；cisplatin sensibility；ovarian cancer；SKOV-3 cell

中圖分類(lèi)號(hào)R737.3

通信作者#，女，1956年4月生，博士，教授，研究方向：婦科腫瘤，E-mail:hrshi2011@163.com

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.01.023