白術多糖對胃癌細胞SGC—7901凋亡的影響

王鶴++陳擁軍++張中華

【摘要】 目的：探討白術多糖對胃癌細胞SGC-7901凋亡的誘導作用。方法：采用不同濃度（30、60.120mg/ml）、不同時間（24、48h）白術多糖注射液處理SGC-7901細胞。流式細胞儀檢測細胞凋亡，Westernblot檢測Bax、Bcl-2蛋白表達，RTRCR檢測p53mRMA。結果：白術多糖注射液對SGC-7901細胞體外凋亡具有促進作用，并呈現(xiàn)劑量及時間成正相關；白術多糖注射液處理后，SGC-7901細胞Bax蛋白表達及Bax/Bcl-2蛋白表達比值顯著升高，Bcl -2蛋白表達顯著降低，并呈現(xiàn)劑量及時間依賴性；SGC-7901細胞P53mRNA表達隨白術多糖濃度的增高而增強。結論：白術多糖促進人胃癌細胞SGC-7901的凋亡，其作用機制可能與上調Bax、p53mRWA和下調Bc1-2表達有關。

【關鍵詞】 白術多糖SGC-7901；細胞凋亡；機制研究

【中圖分類號】R285.5

【文獻標志碼】A

【文章編號】1007-8517（2015）24-0010-02

白術為我國常用中藥之一，為菊科植物白術（Atrac-tylodes macrocephala Koidz）的干燥根莖，其性溫，味甘苦，具有健脾益氣、燥濕利水的功效，臨床用于治療脾胃氣弱、瀉泄、汗出、胎動不安等。藥理研究表明，多糖是中草藥發(fā)揮獨特療效的重要物質基礎，并發(fā)現(xiàn)白術多糖能抑制腫瘤細胞的增殖并誘導其凋亡。研究采用體外培養(yǎng)方法，觀察了不同濃度白術多糖對人胃癌細胞株sGc-7901凋亡和對Bax、Bcl-2、P53mRNA表達的影響，為白術多糖抗胃癌的臨床應用提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 胃癌細胞株SGC-7901（中南大學湘雅醫(yī)院腫瘤研究所）；白術多糖（陜西慈緣生物技術有限公司）；小牛血清、1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶、PBS緩沖液（Gibco公司）；MTT（Sigma公司）；Bcl-2、Bax單抗（Santa Cruz公司）；凋亡試劑碘化丙啶（ PI）和Annexin-V-FITC凋亡試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司）；Trizol試劑（ invitrogen）；DSS（Sigma公司）；Taq酶（鼎國公司）；逆轉錄試劑盒（promega公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)常規(guī)復蘇胃癌細胞株scc-7901，按貼壁方法培養(yǎng)，用含有雙抗（每lOOml分別含青霉素1萬單位和鏈霉素lOmg）及10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，然后用滅菌的5.6% NaHC03調pH值至7.2，置于37℃、5%C0₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每48h用0.25%胰蛋白酶消化傳代，取對數(shù)生長期細胞用于實驗。

1.2.2 細胞凋亡率檢測 收集對數(shù)生長期細胞，DMEM培養(yǎng)液調整細胞濃度為3×104個/ml，將細胞加至96孔板，sooμL/孔，另設不加細胞只加培養(yǎng)液的空白對照孔。將細胞置于37℃、5%C0₂溫箱中培養(yǎng)12h后，加入終濃度為30、60、120mg/ml的白術多糖并在不同時間點（24、48h）對SGC-7901細胞進行預處理，每組設3個復孔，共4組。細胞置37℃、5%C0₂溫箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)結束后1200r/min，離心4min，棄上清液，用流式細胞儀按照試劑盒說明書檢測細胞凋亡率。

1.2.3

Western blot檢測Bax、Bcl-2蛋白表達 30、60、120mg/ml白術多糖注射液處理細胞48h后，提取胞質蛋白，按照Western blot操作步驟進行Bax、Bcl-2蛋白表達檢測。

1.2.4

RT-PCR檢測p53mRNA 用Trizol提取總RNA，然后進行逆轉錄（ RT）及多聚酶鏈式反應（PCR）。基因擴增條件為：94℃變性1min，62℃退火1mm，72℃延伸1min；進行31個循環(huán)，最后54℃ lOmin結束反應。PCR產物經2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，紫外燈下觀察并拍照，用Flour Chem V2.O凝膠成像分析軟件分析不同組別DNA擴增帶的灰度值，以灰度值（p53）/灰度值（β-actin）作為基因p53mRNA的半定量指標。引物由上海生工公司合成，具體如下。

1.2.5 統(tǒng)計學方法數(shù)據(jù)采用SPSS196.0進行分析，計量資料以（x±s）表示，采用t檢驗，計數(shù)資料比較采用X²檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 白術多糖對SGC-7901細胞體外凋亡率的影響 實驗中觀察到各組胃癌細胞數(shù)明顯減少，胞體橢圓變形多發(fā)，同時可見細胞壞死碎片。從表2可知，在不同預處理時間點，不同濃度白術多糖對人胃癌SGC-7901細胞體外凋亡具有促進作用，且與作用時間和處理劑量呈現(xiàn)正相關性。白術多糖濃度越高則對SGC-7901凋亡促進作用越明顯（P

2.2 白術多糖對SGC-7901細胞Bax、Bcl-2蛋白表達的影響不同濃度白術多糖處理人胃癌SGC-7901細胞48h后，Bcl-2蛋白表達顯著降低，而Bax蛋白表達顯著升高，前者與白術多糖濃度呈負相關，后者與白術多糖濃度呈正相關，說明二者可能與白術多糖促進SGC-7901細胞的凋亡機制相關，具體見表3。

2.3 白術多糖對SCC-7901細胞p53mRNA表達的影響由表4可知，隨著白術多糖濃度的增高，SCC-7901細胞p53mRNA表達逐漸增強，說明白術多糖對促進SGC-7901細胞凋亡與p53基因有關系。

3 討論

細胞凋亡是細胞的一種基本生物學現(xiàn)象，在多細胞生物去除不需要的或異常的細胞中起著重要的作用，對生物體的進化、內環(huán)境的穩(wěn)定以及多個系統(tǒng)的發(fā)育起著重要的作用。細細胞凋亡不僅是一種特殊的細胞死亡類型，而且具有重要的生物學意義及復雜的分子生物學機制。一個嚴密完整的程序化死亡過程，需在基因表達的激活、特定信號轉導通路的啟動等調控下進行的自性、有序性死亡，是維持細胞內環(huán)境穩(wěn)定的重要機制。

白術多糖是一種多效的天然活性物質，具有明顯的免疫增強作用，白術多糖能顯著增加小鼠胸腺和脾臟質量，能提高大鼠外周血白細胞的含量及血清免疫球蛋白和補體水平，增加NBT陽性率和血清溶菌酶的含量，促進外周血、脾臟T/B淋巴細胞轉化率。Zhang等研究發(fā)現(xiàn)，注射白術多糖后能明顯減小S180荷瘤小鼠和Lewis肺癌小鼠的瘤重和瘤體比，明顯抑制腫瘤的生長，說明其能降低瘤細胞的增殖率。實驗中，白術多糖干預后，胃癌細胞SGC-7901凋亡率能明顯提高，還可促進Bax蛋白表達的上調和Bcl-2蛋白表達的下調以及上調p53mRNA的表達。研究發(fā)現(xiàn)，Bcl-2是抑制細胞凋亡基因，而Bax是促進細胞凋亡的基因，二者是調控細胞凋亡的重要組成部分。p53基因定位于人類染色體17p13.1，由11個外顯子組成，編碼393個氨基酸組成的53 000的核內磷酸化蛋白，全長約20kb。其參與細胞周期的調控、DNA修復、細胞分化、凋亡等，其激活可加快腫瘤細胞的凋亡。

綜上所述，白術多糖可能通過上調Bax、p53mRNA和下調Bcl-2表達促進人胃癌細胞SGC-7901的凋亡，但其是否可以誘導其他基因，以及具體介導通路仍需深入研究和探討。