甘蔗葉內生真菌Aspergillus niger GZ-4總黃酮含量測定方法研究

周　寧，趙曉璐，謝慶武

(廣西大學生命科學與技術學院，廣西 南寧 530005)

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甘蔗葉內生真菌AspergillusnigerGZ-4總黃酮含量測定方法研究

周寧，趙曉璐，謝慶武

(廣西大學生命科學與技術學院，廣西 南寧 530005)

摘要：采用硝酸鋁顯色法、三氯化鋁顯色法和紫外分光光度法對甘蔗葉內生真菌Aspergillus niger GZ-4總黃酮含量的測定結果進行比較。結果表明：硝酸鋁顯色法和三氯化鋁顯色法不適用于GZ-4菌株總黃酮含量的測定；采用紫外分光光度法，以蘆丁為對照品，在0~0.048 mg·mL-1范圍內吸光度與濃度的線性關系良好(R=0.9999)，平均加樣回收率為101.4%，RSD為1.8%(n=5)。該方法可以簡便、快速、準確地測定GZ-4菌株總黃酮含量。

關鍵詞：甘蔗葉；內生真菌；總黃酮；測定

現代研究表明，植物內生真菌[1]可以產生與宿主植物相同或相似的生理活性物質[2]。近年來，發現產黃酮植物內生真菌的植物逐漸增多，從甘草[3]、桑樹[4]、燈盞花[5]和銀杏[6]中均分離出產黃酮的內生真菌；表明產黃酮植物內生真菌具有豐富的菌種資源，利用植物內生真菌發酵法大規模生產黃酮類化合物具有很大開發價值。目前關于產黃酮植物內生真菌總黃酮含量的測定方法鮮有報道，制約了產黃酮內生真菌的生產應用。

作者采用硝酸鋁顯色法、三氯化鋁顯色法和紫外分光光度法測定甘蔗葉內生真菌Aspergillus nigerGZ-4總黃酮含量，比較了3種方法的測定結果，以期為合理開發利用產黃酮植物內生真菌提供理論依據和檢測手段。

1實驗

1.1　菌種、培養基、試劑與儀器

甘蔗葉內生真菌Aspergillus nigerGZ-4為實驗室自篩，GenBank登錄號為KT726919。

馬鈴薯液體培養基(PDB)：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，自來水1L，pH值自然，121 ℃滅菌20min。

蘆丁標準品(純度99%，批號：TB20150608)，西安天寶生物科技有限公司；乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、三氯化鋁、乙酸鉀、葡萄糖均為分析純。

UV-1240型紫外可見分光光度計，島津(中國)有限公司；HH-4型數顯恒溫水浴鍋，國華電器有限公司；101-2-BS-Ⅱ型電熱恒溫鼓風干燥箱，上海躍進醫療器械有限公司；SCIENTZ-48型高通量組織研磨器，寧波新芝生物科技股份有限公司；SHB-Ⅱ型循環水式多用真空泵，鄭州長城科工貿有限公司。

1.2　方法

1.2.1GZ-4菌株的發酵培養與總黃酮提取液的制備

挑取活化后的GZ-4菌株菌絲體，接種于含有50mLPDB培養基的150mL三角瓶內，置于28 ℃、130r·min-1的搖床內發酵培養7d。將發酵液用雙層濾紙抽濾，得到菌絲體，置于60 ℃恒溫干燥箱內干燥6h，研磨成粉末，即得GZ-4菌株總黃酮提取原料。

取0.1g菌絲體粉末，按料液比1∶40(g∶mL)加入70%(體積分數，下同)乙醇，70 ℃水浴提取2h，離心后得上清液即為GZ-4菌株總黃酮提取液。

1.2.2硝酸鋁顯色法測定總黃酮含量

精密稱取蘆丁10.0mg，用70%乙醇溶解并定容至25mL，制成濃度為0.4mg·mL-1的蘆丁標準液。分別吸取蘆丁標準液200μL和一定量的GZ-4菌株總黃酮提取液置于2mL離心管中，用70%乙醇補足至1mL，各加入60μL質量分數為5%的NaNO2溶液，搖勻后靜置6min；再加入60μL質量分數為10%的Al(NO3)3溶液，搖勻后靜置6min；最后加入0.8mL1mol·L-1的NaOH溶液，用70%乙醇補足至2mL，搖勻后靜置12min。以相應試劑為空白對照，反應結束后在波長420~600nm之間進行光譜掃描，確定兩者最大吸收峰波長。

1.2.3三氯化鋁顯色法測定總黃酮含量

分別吸取蘆丁標準液80μL和一定量的GZ-4菌株總黃酮提取液置于2mL離心管中，加入0.4mL0.1mol·L-1的AlCl3溶液和0.6mL1mol·L-1的KAc溶液，搖勻后用70%乙醇補足至2mL，靜置30min。以相應試劑為空白對照，反應結束后分別在波長320~500nm之間進行光譜掃描，確定最大吸收峰波長。

1.2.4紫外分光光度法測定總黃酮含量

分別吸取蘆丁標準液90μL和一定量的GZ-4菌株總黃酮提取液置于2mL離心管中，用70%乙醇補足至2mL。以70%乙醇為空白對照，分別在波長220~400nm處進行光譜掃描，確定最大吸收峰波長。

2結果與討論

2.1　總黃酮測定方法與最適波長的選擇

2.1.1硝酸鋁顯色法測定結果

蘆丁標準液和樣品液在波長420~600 nm范圍內進行光譜掃描，發現蘆丁標準液在510 nm處存在明顯吸收峰，樣品液在510 nm附近并未發現明顯吸收峰(圖1)。表明，硝酸鋁顯色法不適用于GZ-4菌株總黃酮含量的測定。

圖1　硝酸鋁顯色法的紫外吸收光譜

2.1.2三氯化鋁顯色法測定結果

蘆丁標準液和樣品液在波長320~500 nm范圍內進行光譜掃描，發現蘆丁標準液在420 nm處有最大吸收峰，樣品液在360 nm處有最大吸收峰(圖2)，兩者最大吸收峰所在波長相差甚遠。表明，三氯化鋁顯色法不適用于GZ-4菌株總黃酮含量的測定。

圖2　三氯化鋁顯色法的紫外吸收光譜

2.1.3紫外分光光度法測定結果

蘆丁標準液和樣品液在波長220~400 nm范圍內進行光譜掃描，發現蘆丁標準液在257 nm處有最大吸收峰，樣品液在257 nm附近也有最大吸收峰(圖3)，兩者在257 nm處有共同吸收峰，表明，紫外分光光度法可以用于GZ-4菌株總黃酮含量的測定，且選擇257 nm作為測定波長。

圖3　紫外分光光度法的紫外吸收光譜

2.2　紫外分光光度法方法學考察

2.2.1線性關系考察

精密吸取蘆丁標準液0 μL、20 μL、40 μL、80 μL、120 μL、160 μL、200 μL分別置于2 mL離心管中，按照1.2.4方法制得樣品液，于257 nm處測定其吸光度。以吸光度(A)為縱坐標、蘆丁濃度(c)為橫坐標繪制標準曲線(圖4)，得到線性方程為：A=33.208c-0.0035，相關系數R=0.9999。表明在蘆丁濃度為0~0.040 mg·mL-1范圍內線性關系良好。

圖4　蘆丁標準曲線

2.2.2精密度考察

精密吸取50 μL蘆丁標準液5份，按照1.2.4方法制得樣品液，測定吸光度，RSD值為1.3%。表明儀器精密度良好。

2.2.3穩定性考察

精密吸取蘆丁標準液50 μL和GZ-4菌株總黃酮提取液20 μL，按照1.2.4方法制得樣品液，測定吸光度，每隔10 min測定一次，共測定5次，RSD值分別為0.7%和0.5%。表明在50 min內蘆丁標準液和樣品液穩定性良好。

2.2.4重復性考察

精密吸取20 μL GZ-4菌株總黃酮提取液5份，按照1.2.4方法制得樣品液，測定吸光度，RSD值為1.0%，表明該方法重復性良好。

2.2.5加樣回收率考察

精密吸取相同體積的5份GZ-4菌株總黃酮提取液15 μL，分別加入蘆丁標準液20 μL、40 μL、60 μL、80 μL、100 μL，按照1.2.4方法制得樣品液，測定吸光度，結果平均加樣回收率為101.4%，RSD值為1.8%，表明回收率良好。

2.3　討論

總黃酮含量的測定方法有多種，主要有紫外分光光度法、顯色法、高效液相色譜法等[7-8]，但目前對產黃酮植物內生真菌代謝產物的黃酮類具體成分及種類仍缺乏相應研究，限制了高效液相色譜法在測定內生真菌總黃酮含量上的應用。

硝酸鋁顯色法的原理[9]是：在堿性條件下與黃酮醇類成分鄰位無取代的鄰二酚羥基部位發生絡合，而無鄰二酚羥基的黃酮類物質不能顯色。文獻[10]指出硝酸鋁顯色法檢測槲皮素時在510 nm處并無最大吸收峰，而薄層層析色譜顯示GZ-4菌體醇提取物中含有槲皮素或與槲皮素相類似的黃酮類化合物。

三氯化鋁顯色法的原理[11]是：反應主要在3-羥基、4-羥基和鄰二酚羥基，某些黃酮類物質只存在5-羥基和4-羥基時是不能和三氯化鋁發生反應的。因此，以上2種測定方法有較高的局限性，專屬性不強，并不是通用的總黃酮測定方法。

紫外分光光度法的原理[12]是：利用大多數黃酮類化合物在峰帶Ⅰ(300~400 nm)和峰帶Ⅱ(220~280 nm)光譜區的吸光度來進行測定。具有簡便、適用性廣、準確、精密等特點，已準確測定了荷葉、羅布麻和寧夏枸杞子等總黃酮含量[13-15]。

本研究首次采用紫外分光光度法準確測定了產黃酮甘蔗葉內生真菌GZ-4總黃酮含量，為其它產黃酮植物內生真菌總黃酮含量的測定提供了參考。

3結論

比較了紫外分光光度法、硝酸鋁顯色法和三氯化鋁顯色法測定產黃酮甘蔗葉內生真菌GZ-4總黃酮含量的適用性。結果表明，常用的硝酸鋁顯色法和三氯化鋁顯色法并不適用于GZ-4菌株總黃酮含量的測定，而紫外分光光度法則適合產黃酮內生真菌GZ-4菌株總黃酮含量的測定，對開發利用產黃酮植物內生真菌有一定的意義。

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Content Determination of Total Flavonoids in Endophytic Fungi

AspergillusNigerGZ-4 from Sugarcane Leaves

ZHOU Ning，ZHAO Xiao-lu，XIE Qing-wu

(CollegeofLifeScienceandTechnology，GuangxiUniversity，Nanning530005，China)

Abstract：A comparison was made for determination of total flavonoids in endophytic fungi Aspergillus niger GZ-4 from sugarcane leaves by NaNO2-Al(NO3)3-NaOH colorimetry，AlCl3colorimetry and UV spectrophotometry.Results showed that NaNO2-Al(NO3)3-NaOH colorimetry method and AlCl3colorimetry method were not suitable to determine total flavonoids in strain GZ-4.Total flavonoids in strain GZ-4 was successfully determined by UV spectrophotometry with rutin as reference substance.The linear ranges of rutin were 0~0.048 mg·mL-1(R=0.9999) and the average recovery was 101.4% with corresponding RSD of 1.8%(n=5).This method is convenient，rapid，accurate and suitable for determination of total flavonoids in strain GZ-4.

Keywords：sugarcane leaves;endophytic fungi;total flavonoids;determination

中圖分類號：O 657.32

文獻標識碼：A

文章編號：1672-5425(2016)01-0063-04

作者簡介：周寧(1990-)，男，河南新蔡人，碩士研究生，研究方向：微生物制藥、藥物化學，E-mail:zhaoxiaoluw@126.com；通訊作者：謝慶武，副研究員，E-mail:XQW@gxu.edu.cn。

收稿日期：2015-10-06

基金項目：廣西壯族自治區研究生教育創新計劃資助項目(P3130098105)

doi：10.3969/j.issn.1672-5425.2016.01.016