舒更葡糖鈉注射液與羅庫溴銨的體外結合與釋放

唐 朝 孟芳 鄧漢生

舒更葡糖鈉為特異性結合性神經肌肉阻滯拮抗藥物[1]。其是一種經修飾的γ-環糊精，通過與神經肌肉阻滯藥物羅庫溴銨或維庫溴銨在血漿中形成復合物，進而降低在神經肌肉接頭處與煙堿受體相結合的神經肌肉阻滯藥物的數量，由此拮抗由羅庫溴銨或維庫溴銨誘導的神經肌肉阻滯[2-3]。

本研究采用等溫滴定量熱法（ITC）[4-5]和高效液相色譜法（HPLC）[6]開展不同廠家舒更葡糖鈉注射液與羅庫溴銨的體外結合及其釋放行為研究，評價不同廠家舒更葡糖鈉注射液與羅庫溴銨結合及釋放特征，以期為臨床合理用藥提供參考和依據。

1 儀器、試劑與方法

1.1 儀器、試劑

儀器：MicroCal PEAQ-ITC等溫滴定量熱儀（Malvern），1260 Infinity Ⅱ高效液相色譜儀（Agilent）。

試劑：舒更葡糖鈉注射液（含量：100 mg/ml，批號：U035232，布瑞亭，A制劑，默沙東(中國)投資有限公司），舒更葡糖鈉注射液（含量：100 mg/ml，仿制藥，B制劑，揚子江藥業集團有限公司），羅庫溴銨對照品（含量：＞98%，大連博格林生物科技有限公司），羅庫溴銨注射液（含量：10 mg/ml，浙江仙琚制藥股份有限公司），四甲基氫氧化銨（分析純，上海阿達瑪斯試劑有限公司），乙腈（≥99.9%，西格瑪奧德里奇（上海）有限公司），磷酸（分析純），實驗用水為超純水。

1.2 方法

1.2.1 ITC測定羅庫溴銨的結合常數

1.2.1.1 受試化合物溶液的制備室溫條件下受試化合物溶液的制備：用超純水稀釋舒更葡糖鈉注射液及羅庫溴銨注射液，分別配制舒更葡糖鈉最終濃度為0.1 mmol/L，羅庫溴銨為1.0 mmol/L。高溫條件下受試化合物溶液的制備：將舒更葡糖鈉注射液置于60 ℃條件下10 d后進行測定，用超純水分別稀釋舒更葡糖鈉注射液及羅庫溴銨注射液，分別配制舒更葡糖鈉最終濃度為0.1 mmol/L，羅庫溴銨為1.0 mmol/L。光照條件下受試化合物溶液的制備：將舒更葡糖鈉注射液置于4 500 Lx，25 ℃，60%相對濕度（RH）條件下放置10 d后進行測定，用超純水稀釋舒更葡糖鈉注射液及羅庫溴銨注射液，分別配制舒更葡糖鈉最終濃度為0.1 mmol/L，羅庫溴銨為1.0 mmol/L。1%血清白蛋白（BSA）受試化合物溶液的制備：用含1%BSA的超純水溶液稀釋舒更葡糖鈉注射液及羅庫溴銨注射液，配制舒更葡糖鈉最終濃度為0.1 mmol/L，羅庫溴銨為1.0 mmol/L。

1.2.1.2 樣品測定樣品池注入280 μl待滴定的舒更葡糖鈉溶液，40 μl羅庫溴銨溶液裝入注射器，恒溫至25 ℃，控制攪拌速率為750 r/min，待儀器自動平衡后，記錄60 s后開始滴定，連續滴定19滴，首滴0.4 μl，后18滴2 μl，間隔時間為150 s。

1.2.2 羅庫溴銨HPLC的建立色譜柱：C18柱（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）；流動相：乙腈-4.53 g/L四甲基氫氧化銨溶液（體積比為90∶10，用磷酸調節pH至7.4）；檢測波長：210 nm；流速：1.0 ml/min；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μl。

1.2.3 羅庫溴銨與不同廠家舒更葡糖的結合速率評價5 ml 2.0 mg/ml的羅庫溴銨溶液分別與不同廠家5 ml 6.6 mg/ml舒更葡糖鈉溶液混合均勻后37 ℃孵育，分別在10 min、20 min、30 min時用1 000 Da超濾管超濾分離游離藥物。過濾樣品溶液采用HPLC測定游離羅庫溴銨的濃度，根據游離藥物與加入藥物的濃度計算藥物結合率。

1.2.4 羅庫溴銨與不同廠家舒更葡糖結合后的釋放行為評價1 ml 10.0 mg/ml羅庫溴銨溶液與1 ml 33.3 mg/ml舒更葡糖鈉溶液在37 ℃混合孵育20 min后，將其分別置于100 ml 磷酸鹽緩沖液（PBS）和100 ml含有1%BSA的PBS中（37 ℃搖床，75轉/min），分別在5 min、10 min、20 min、30 min時取液2 ml（取液后立即補液2 ml），立即用超濾管（1 000 Da）高速離心。過濾液采用HPLC測定釋放的游離羅庫溴銨濃度。

1.2.5 數據處理采用MicroCal PEAQ-ITC Analysis Software軟件中one binding site model對每組滴定數據分別進行擬合，得到每組滴定反應的結合常數及相關熱力學常數。數據分析和比較采用GraphPad Prism 8（GraphPad Software Inc.，La Jolla，CA，USA）和Excel軟件。兩組之間的統計比較采用雙尾Studentt檢驗。多個（兩個以上）組之間的統計比較采用單因素方差分析（ANOVA）和Tukey事后檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 舒更葡糖鈉與羅庫溴銨結合的ITC結果

表1結果表明，舒更葡糖鈉與羅庫溴銨具有極強的藥物結合能力，其結合常數KD均小于10-5mol/L。在常溫條件下，B制劑的舒更葡糖鈉KD值顯著高于A制劑（P＜0.05）。光照與高溫條件對各制劑與羅庫溴銨的結合常數KD值未有顯著影響（P＞0.05）。加入1%BSA后，B制劑的KD值高于A制劑，但差異無統計學意義（P＞0.05），各制劑的KD值均顯著增大（P＜0.05），提示在血清存在條件下，羅庫溴銨可能和血清蛋白存在競爭性結合舒更葡糖鈉。

表1 舒更葡糖鈉和羅庫溴銨結合相關熱力學參數(n=6)

2.2 羅庫溴銨與不同廠家舒更葡糖鈉的結合率與結合速率

羅庫溴銨與不同廠家舒更葡糖鈉的結合率結果如圖1～2所示。羅庫溴銨與不同廠家舒更葡糖鈉的結合率結果表明：舒更葡糖與羅庫溴銨以近似1∶1的分子比例（質量比1∶3.3）結合，且超濾可將游離羅庫溴銨與舒更葡糖羅庫溴銨結合物有效分離。在10 min時大部分羅庫溴銨與舒更葡糖快速結合，在20 min已基本全部結合。B制劑在5 min時的結合率和結合速率均顯著低于A制劑（P＜0.05）。

圖1 羅庫溴銨與不同廠家舒更葡糖鈉的結合速率(n=6)

圖2 羅庫溴銨與不同廠家舒更葡糖鈉混合5 min時的結合速率比較(n=6)

2.3 羅庫溴銨與不同廠家舒更葡糖結合后的釋放行為

羅庫溴銨與不同廠家舒更葡糖結合后的釋放結果表明：羅庫溴銨與舒更葡糖結合物在PBS（pH 7.4）釋放介質中各時間點均未測到游離的羅庫溴銨，表明羅庫溴銨與舒更葡糖均能以結合物的形式存在，結合物穩定性較強。當釋放介質中存在BSA時，僅B制劑在5 min時測得極少量游離藥物釋放，而在其他時間點和A制劑各時間點均未測到游離藥物。

3 討論

本研究采用ITC測定了舒更葡糖鈉與羅庫溴銨的結合力，該方法靈敏度高，專屬性較好。實驗結果也確證舒更葡糖鈉與羅庫溴銨的結合常數KD均小于10-5mol/L，呈現出極強的羅庫溴銨結合能力。兩個廠家的舒更葡糖鈉制劑與羅庫溴銨結合力具有一定的差異性，其中與A制劑（原研藥）的KD值相比B制劑顯著降低，約為原研藥的58%，提示其體內拮抗羅庫溴銨的能力可能弱于A制劑。加入1%BSA后，羅庫溴銨的KD值與正常條件下相比均顯著增大，提示在血清存在條件下，羅庫溴銨可能和血清蛋白存在競爭性結合舒更葡糖。

羅庫溴銨與舒更葡糖鈉結合與釋放行為的評價結果進一步驗證了羅庫溴銨與舒更葡糖鈉具有極強的結合力[7]，在PBS（pH7.4）釋放介質中均能以藥物-環糊精結合物的形式存在，并且結合物的穩定性較好[8]，而當釋放介質中存在BSA時，僅發現B制劑在早期時（5 min）有極少游離藥物釋放，而A制劑未測到游離藥物，提示在血清競爭性結合下可能導致弱結合藥物從環糊精上快速釋放。據該藥品說明書，舒更葡糖鈉注射液中含有單-羥基舒更葡糖，而單-羥基舒更葡糖與羅庫溴銨和維庫溴銨之間的親和力約為舒更葡糖的50%。因此，引起不同廠家舒葡糖鈉與羅庫溴銨結合力和早期釋放特性差異的原因可能是不同制劑中單-羥基舒更葡糖含量存在差異。