Rab27B mRNA在胃癌和胃癌前病變組織中的表達及臨床意義

李琪兒+葉國良+郭俊明

[摘要] 目的 了解Rab27B mRNA在胃癌組織和胃癌前病變組織中的表達情況及及其臨床意義。 方法 應用實時定量逆轉錄聚合酶鏈反應（quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction，qRT-PCR）技術檢測胃癌組織及配對的癌旁組織中Rab27B mRNA的表達量；應用qRT-PCR技術檢測胃癌前病變組織及配對的正常胃黏膜組織中Rab27B mRNA的表達量。 結果 Rab27B mRNA不僅在胃癌組織中表達降低（P=0.009），而且在胃癌前病變組織中表達也降低（P=0.013）。Rab27B mRNA在胃癌組織中的表達量較癌旁組織平均降低1.8倍。Rab27B mRNA的表達量與胃癌的分化程度有關（P=0.009）。 結論 Rab27B mRNA可能參與了胃癌的發生，具有成為胃癌腫瘤標志物的潛在價值。

[關鍵詞] Rab27B；胃癌；胃癌前病變；腫瘤標志物

[中圖分類號] R735.2 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2015）26-0004-04

Expression and its clinical significance of Rab27B mRNA in gastric cancer and gastric premalignant lesions

LI Qier1 YE Guoliang1 GUO Junming2

1.Department of Gastroenterology， the Affiliated Hospital of Ningbo University School of Medicine， Ningbo 315020， China；2.Ningbo University School of Medicine， Ningbo 315211， China

[Abstract] Objective To understand the expression of Rab27B mRNA in gastric cancer and gastric premalignant lesions and its clinical significance. Methods Quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction（qRT-PCR） was used to detect Rab27B mRNA expression in gastric cancer tissues and adjacent non-tumorous tissues. Then， Rab27B mRNA expression in gastric premalignant lesions and matched normal tissues were explored. Results Rab27B mRNA was not only significantly down-regulated in gastric cancer tissues（P=0.009）， but also decreased in gastric Premalignant lesions（P=0.013）. Compared to paired adjacent normal tissues， Rab27B mRNA was down-regulated with an average level 1.8-fold in cancer tissues. The expression level of Rab27B mRNA was closely correlated with poor differentiation（P=0.009）. Conclusion Rab27B mRNA may play important role in gastric cancer initiation and it has potential capacity to be tumor marker for gastric cancer.

[Key words] Rab27B； Gastric cancer； Premalignant lesion； Tumor marker

我國是胃癌高發地區，其發病率居惡性腫瘤第2位，死亡率居惡性腫瘤死因第3位[1]。早期診斷對胃癌的預后起著至關重要的作用。早期胃癌的5年生存率可達90%以上，而進展期胃癌則不足50%[2-3]。由于傳統的腫瘤標志物癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）等診斷胃癌的靈敏度和特異度均不高，因此有必要尋求新型的生物學標志物。Rab27B是致癌基因RAS家族成員之一，目前已發現其與肝癌、乳腺癌、結腸癌相關[4-6]。我們應用實時定量逆轉錄-聚合酶鏈反應（quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction， qRT-PCR）技術檢測了Rab27B mRNA在胃癌組織和胃癌前病變組織中的表達量，并分析其與胃癌患者臨床病理因素的關系，為Rab27B mRNA成為胃癌篩查和早期診斷的標志物提供了重要的實驗室依據。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

從2012年12月～2014年4月于寧波大學醫學院附屬醫院和鄞州人民醫院共收集胃癌組織101例、胃癌前病變組織30例。101例胃癌患者中男73例，女28例，年齡39～81歲，平均（64.2±9.5）歲。30例胃癌前病變患者中男18例，女12例，年齡38～81歲，平均（60.8±10.4）歲。所有胃癌患者均經過外科手術，術后病理確診胃癌，且術前均未接受任何放化療；所有胃癌前病變患者均經過內鏡黏膜下剝離（endoscopic submueosaI dissection，ESD）術，術后病理確診胃黏膜中重度異型增生。用于本實驗研究的人體標本均事先由患者或其委托人簽署知情同意書并得到了寧波大學醫學倫理委員會的批準。采集所有病變組織標本的同時采集相應的距離病灶大于5 cm處正常組織1份，采集的新鮮組織標本立即浸泡于無氮樣品保存液中，-80℃下保存備用。

1.2 試劑

無氮樣品保存液購自北京百泰克生物技術有限公司；Trizol試劑購自德國Invitrogen公司；GoScriPt逆轉錄試劑盒和GoTaqR qPCR Master Mix試劑盒均購自美國Promega公司。

1.3 實驗方法

應用Trizol法抽提組織總RNA，提取的總RNA用紫外分光光度計測定濃度并檢測質量。A260/A280在1.8～2.0范圍內可認為總RNA純度可靠。取2 μg總RNA用于逆轉錄合成cDNA，逆轉錄反應采用GoScriPt逆轉錄試劑盒。所獲得的cDNA稀釋5倍后作為模板，采用GoTaqR qPCR Master Mix試劑盒，在Mx3005P熒光定量PCR儀（Srratagene公司）上檢測Rab27B mRNA的表達量。Rab27B mRNA的引物序列：上游：5'-AGGCTATTCTCTGGGATGAGTG-3'，下游：5'-TCTGCTGTATTTAAGGGCACAA-3'；外參甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）的引物序列：上游：5'-ACCCACTCCTCCACCTTTGAC-3'，下游：5'- TGTTGC TGTAGCCAAATTCGTT-3'。擴增條件設定：95℃ 5 min（預變性），94℃ 15 s（變性），54℃ 30 s（退火），70℃ 30 s（延伸）。循環40次。

1.4 結果判定

采用ΔCt法計算Rab27B mRNA相對表達量。計算公式：ΔCt=Ct（Rab27B）-Ct（GAPDH），ΔΔCt=Ct（實驗組）-Ct（對照組）。ΔCt值越小則表達量越高。實驗組是指胃癌組織及癌前病變組織，對照組是指相對應的癌旁組織和正常組織，實驗組目的基因的表達量相對于對照組變化的倍數用2ΔΔCt來表示。

1.5 統計學分析

采用SPSS17.0統計軟件進行分析，分別采用兩獨立樣本t檢驗（unpaired students t-test）、配對樣本t檢驗（paired students t-test）和方差分析（ANOVA），P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Rab27B mRNA在胃癌組織中的表達情況

應用qRT-PCR技術檢測101對胃癌組織和配對癌旁組織中Rab27B mRNA的表達量，結果顯示，Rab27B mRNA在胃癌組織中的表達量顯著低于癌旁組織（P=0.009，封三圖3），平均降低1.8倍。61%（62/101）胃癌組織中Rab27B mRNA的表達量低于癌旁組織。

2.2 Rab27B mRNA在胃癌前病變組織中的表達情況

應用qRT-PCR技術檢測30對胃癌前病變組織和配對正常組織中Rab27B mRNA的表達量，結果顯示，Rab27B mRNA在胃癌前病變組織中的表達量也顯著降低（P=0.013，封三圖4）。

2.3 Rab27B mRNA的表達量與胃癌患者臨床病理因素的關系

進一步比較Rab27B mRNA水平與胃癌患者臨床病理因素的關系，包括年齡、性別、TNM分期[7]、浸潤深度、腫瘤大小、分化程度和淋巴結轉移情況。結果顯示，Rab27B mRNA水平與胃癌的分化程度相關（P= 0.009，表1），其表達水平越低，則分化程度也越低。

表1 Rab27B mRNA的表達水平（ΔCt）與胃癌患者臨床病理因素的關系（x±s）

3 討論

目前我國的早期胃癌診斷率不足10%[8]。胃癌的診斷主要依靠內窺鏡檢查，由于內窺鏡檢查的有創性注定其不適于廣泛篩查。有文獻報道，大范圍篩查有助于提高早期胃癌的檢出率[9]。理想的篩查手段不僅要具備無創、快捷、經濟等特點，還應該具備高靈敏度和特異度，但傳統的腫瘤標志物如CEA，它的靈敏度和特異度分別僅為30%[10]和23.2%[11]。為此，我們希望能夠發現更為理想的候選腫瘤標志物。

Rab蛋白屬于Ras家族的小GTP酶，參與和調節囊泡的運輸[12]。Rab27由Rab27A和Rab27B組成。相對于Rab27A，Rab27B的表達更為局限，主要表達于腦垂體、膀胱、結腸、胃和胰腺[13-16]。

研究最早的是Rab27B與乳腺癌的關系。Hendrix等[4]發現Rab27B調節雌激素受體（estrogen receptor，ER）陽性的乳腺癌細胞侵襲性生長和轉移，Rab27B的高表達與乳腺癌的不良預后密切相關。此后又有研究顯示Rab27B的高表達與乳腺癌的淋巴結轉移、臨床分期晚、病理分型惡性程度高有關，Rab27B表達量高的患者生存期較短[17]。新近研究發現結腸癌組織中Rab27B的表達量均明顯高于癌旁組織，且Rab27B蛋白的表達與淋巴結轉移、遠處轉移和TNM分期有關[5]。但Rab27B卻被證實在原發性肝癌組織中的表達量較癌旁組織降低[6]。我們的研究發現Rab27B mRNA在胃癌組織中的表達也降低。由此可見，Rab27B既可作為致癌基因又可作為抑癌基因，其在胃癌和肝癌中的作用機制可能不同于乳腺癌和結腸癌。我們進一步分析了Rab27B mRNA的表達量與胃癌患者臨床病理因素的關系，結果發現Rab27B mRNA的低表達與分化程度低有關。

胃黏膜異型增生是胃黏膜發生癌變的關鍵階段，被認為是胃癌前病變[8]，目前已有研究發現很多癌癥相關基因在癌前病變組織中已出現了異常表達。Gibb等[18]進行了一項人類口腔黏膜癌及癌前病變的lncRNA表達圖譜，發現在癌組織中異常表達的lncRNA中有60%在癌前病變組織中也存在異常表達。Shao等[19]證實HMlincRNA717在胃癌組織和胃黏膜異型增生組織中的表達量均較正常黏膜降低。屈王蕾等[20]通過免疫組織化學法檢測ToPoⅡα蛋白在正常宮頸組織、宮頸癌癌前病變組織-宮頸上皮內瘤變（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）和宮頸鱗癌組織中的表達，結果發現TopoⅡα蛋白表達在CINⅡ、CINⅢ和宮頸鱗癌組織中上調。本研究發現Rab27B mRNA不僅僅在胃癌組織中低表達，而且在胃癌前病變組織中也表達降低，說明Rab27B可能在胃癌的發生過程中起重要作用。

綜上所述，Rab27B mRNA在胃癌組織及胃癌前病變組織中均呈現低表達，有可能成為胃癌篩查和早期診斷的新型標志物。

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（收稿日期：2015-05-18）