病理活檢組織自動脫水方法及改進(jìn)

李孜孜

[摘要] 目的 保證活檢組織標(biāo)本脫水和浸蠟的質(zhì)量，減少試劑的損耗，制作優(yōu)質(zhì)的石蠟組織塊。 方法 2013年11月～2015年7月使用全自動脫水機(jī)的脫水過程中，通過試劑更換和管道清洗，以及對脫水機(jī)使用、維護(hù)、保養(yǎng)和常見故障排除等方面進(jìn)行探討。 結(jié)果 活檢標(biāo)本處理質(zhì)量高，HE 染色后形態(tài)清晰。維持了組織原有的形態(tài)和最接近細(xì)胞生存狀態(tài)中的蛋白質(zhì)和DNA，為免疫組織化學(xué)、特殊染色、分子病理等技術(shù)方法奠定基礎(chǔ)。 結(jié)論 脫水是病理技術(shù)中的重要環(huán)節(jié)，需要技術(shù)人員高度的責(zé)任心，并通過觀察總結(jié)出一套適合本科室工作的脫水方法和流程。

[關(guān)鍵詞] 病理制片；活檢標(biāo)本；固定液；脫水試劑；HE染色

[中圖分類號] R361.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] B [文章編號] 1673-9701（2015）25-0109-03

Automatic dehydration method and improvement of pathological biopsy tissue

LI Zizi

Department of Pathology， the Fifth Hospital Affiliated to SunYat-sen University， Zhuhai 519000， China

[Abstract] Objective To ensure the quality of dehydrated and paraffin wax， reduce the loss of the reagent， and make the high quality paraffin block. Methods From November 2013 to July 2015， the dehydration process of the automatic dehydration machine， the use of reagent and pipeline cleaning to discuss the use， maintenance， maintenance and common trouble shooting of the dewatering machine. Results The quality of the biopsy specimen was improved， and the morphology of HE staining was clear. To maintain the original form of the organization and the most close to the cell viability of the protein and DNA， as the immune tissue chemistry， special staining， molecular pathology and lay the foundation for other technical methods. Conclusion Dehydration is an important part in the pathology technology， it needs a high degree of responsibility， and a summary a practical system for this work.

[Key words] Pathological section； Biopsy； Formalin； Dehydrator； HE stain

隨著醫(yī)院門診及手術(shù)量的增加，越來越多的醫(yī)生會對患者進(jìn)行活體組織檢查，希望能通過此項(xiàng)檢查給予疾病明確的診斷，并對于后續(xù)的治療給予正確的方向。隨著病理技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，對組織標(biāo)本的處理要求日益提高，其中包括免疫組織化學(xué)檢查以及個(gè)性化、私人訂制的分子病理檢查。目前也是在脫水后的石蠟包埋標(biāo)本上進(jìn)行制作，因此保持活體組織的形態(tài)、保存細(xì)胞中的蛋白質(zhì)和DNA顯得尤其重要。全自動密閉式組織脫水機(jī)是目前廣大醫(yī)院脫水的基本設(shè)備，是病理技術(shù)工作的重要組成部分。高質(zhì)量的處理標(biāo)本，減少故障率，維持脫水機(jī)的正常運(yùn)轉(zhuǎn)，以至于每日取材標(biāo)本都能按時(shí)制片，最終能才夠確保病理報(bào)告的按時(shí)發(fā)出，因此顯得尤為重要[1]。

組織脫水過程是一個(gè)物理化學(xué)變化的過程，乙醇作為脫水劑，是因?yàn)橐掖家兹苡谒芘c水以任何比例混合。組織浸泡在乙醇后，組織內(nèi)水分被乙醇所替代。組織在梯度酒精內(nèi)完全脫水后，通過二甲苯作為媒介，置換出組織中的乙醇，然后被融化的石蠟所填充。

1 資料與方法

1.1 材料與儀器

我院活檢標(biāo)本和外科手術(shù)標(biāo)本。儀器：Thermofisher Excelsior ES型全自動密閉式組織脫水機(jī)，每臺附帶不銹鋼脫水籃1只，可容納300個(gè)包埋盒，塑料包埋盒為國內(nèi)產(chǎn)品。我們科室在2013～2015年購置了Thermofisher Excelsior ES脫水機(jī)，使用過程中在科學(xué)理論指導(dǎo)下，聯(lián)系實(shí)際，總結(jié)出一套適合廣東氣候和本科室工作程序的脫水程序。

1.2 方法

標(biāo)本取材后放入脫水機(jī)，總時(shí)間為13 h。該脫水程序，適合內(nèi)鏡標(biāo)本、皮膚標(biāo)本以及手術(shù)標(biāo)本。脫水設(shè)置程序?yàn)?%中性甲醛Ⅰ30 min、4%中性甲醛Ⅱ45 min、70%乙醇45 min、80%乙醇45 min、95%乙醇60 min、95%乙醇75 min、無水乙醇Ⅰ90 min、無水乙醇Ⅱ90 min、二甲苯Ⅰ20 min、二甲苯Ⅱ20 min、二甲苯Ⅲ20 min、石蠟Ⅰ60 min、石蠟Ⅱ90 min、石蠟Ⅲ90 min[2-4]。

1.2.1 初次固定 采用10%中性緩沖福爾馬林浸泡標(biāo)本。其使用廣泛，易于配制，穿透速度快，組織硬化程度小。保存細(xì)胞的基本形態(tài)，維持接近細(xì)胞生活狀態(tài)的蛋白質(zhì)和DNA且細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)的微細(xì)部分均保存良好，也可進(jìn)行免疫組化染色。我們科室在收到當(dāng)天的門診活檢標(biāo)本或手術(shù)標(biāo)本均固定至次日，待標(biāo)本充分固定后再取材。

1.2.2 二次固定 取材時(shí)也將取好的組織塊放置于10%中性緩沖福爾馬林，這樣在取材的數(shù)小時(shí)中可以讓標(biāo)本進(jìn)一步的固定，讓處于標(biāo)本深部地方充分固定[5]。

1.2.3 三次固定 取材結(jié)束后，將標(biāo)本放置入全自動脫水機(jī)中繼續(xù)固定，我們科室常用AAF 液（甲醛150 mL、95%乙醇800 mL、冰醋酸50 mL 配成1000 mL），固定時(shí)間為2 h[6]。

1.3 觀察指標(biāo)

經(jīng)過自動脫水機(jī)處理較好的組織，顏色呈均勻淡黃色、硬度適中、無發(fā)白區(qū)、放置一段時(shí)間后組織無凹陷、適宜包埋和切片[7]。制作出的切片完整、厚度適宜、核深色清晰、核質(zhì)分明、透明度好。用于制作HE染色、特殊染色、免疫組織化學(xué)染色、分子病理等，利于醫(yī)師判讀和診斷[8]。優(yōu)質(zhì)切片質(zhì)控指標(biāo)見表1。

表1 優(yōu)質(zhì)切片質(zhì)控指標(biāo)

2 結(jié)果

2.1 處理效果

經(jīng)該程序處理的組織標(biāo)本脫水、透明和浸蠟充分，軟硬適中，有彈性，效果好，組織切片厚2～3 μm。制作的切片達(dá)到優(yōu)質(zhì)切片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，優(yōu)質(zhì)切片每項(xiàng)分?jǐn)?shù)都要求達(dá)到90%以上[9]。

2.2 HE染色色彩明亮

顏色鮮艷，蘇木素和伊紅顏色分明，細(xì)胞核結(jié)構(gòu)清晰，尤其是內(nèi)鏡和穿刺標(biāo)本組織等細(xì)小標(biāo)本中制作優(yōu)良著色佳[10]。

2.3 特殊染色陽性色彩突出

陽性結(jié)果反應(yīng)顏色易于區(qū)分和識別，層次清楚，對比明顯。

2.4 免疫組織化學(xué)染色、特異性染色區(qū)域和陰性區(qū)域分明[11]

組織切片中棕黃色反應(yīng)產(chǎn)物著色清晰可見，上色均勻，陰陽對比明顯。

2.5 分子病理利于DNA的擴(kuò)增和探針的雜交

DNA結(jié)構(gòu)保存完好，信號強(qiáng)度清晰，易于判讀。

2.6 故障率降低

在使用的3年時(shí)間內(nèi)，脫水機(jī)故障率為零。

2.7 脫水效果

不同染色HE染色比較示例[12]。①腺瘤性息肉標(biāo)本：圖1脫水效果不佳，細(xì)胞結(jié)構(gòu)不清，不利于診斷；圖2脫水效果佳，細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，診斷較明確。②鼻咽未分化型非角化性癌標(biāo)本：圖3脫水效果不佳，透明度不好，不利于診斷；圖4脫水效果佳，顏色分明，核清晰，診斷較明確。

3 討論

組織處理幾點(diǎn)重要因素：固定應(yīng)及時(shí)、脫水要徹底、透明宜充分、浸蠟需足夠。

3.1 固定組織固定的目的

固定組織固定的目的在于保存組織基本結(jié)構(gòu)和形態(tài)，是脫水的第一步也是最關(guān)鍵的一步。固定不佳的組織形態(tài)模糊不清，免疫組織染色不佳[13]。活檢組織離體后要盡快放置進(jìn)入固定液。這樣不僅可以防止組織的自溶改變，而且還可以防止組織中的蛋白質(zhì)和DNA分解和變性。所以，固定標(biāo)本尤其是固定大塊或條索狀標(biāo)本時(shí)要盡可能的保持標(biāo)本正常時(shí)的狀態(tài)，不得發(fā)生扭曲。淋巴結(jié)等不易固定透的組織要切開固定。組織最佳的固定時(shí)間為12～72 h。

3.2固定試劑的更換

二次固定液每天更換，三次固定液使用滿1000組織塊就需更換一次。每次更換時(shí)Thermofisher Excelsior ES脫水機(jī)共有兩道固定液，每次更換固定液Ⅰ，然后將固定液Ⅱ向前挪，再將新配置的AAF固定液放在固定液Ⅱ缸中。

3.3 脫水試劑的更換

本科室梯度酒精1個(gè)月更換1次，一般能處理4000個(gè)組織塊，基本方法為輪換下第一道酒精，后面的酒精依次向前挪。二甲苯也1個(gè)月更換1次，將二甲苯Ⅰ排出，將二甲苯Ⅱ向前挪，在空置的二甲苯Ⅱ缸中放入新的二甲苯。

3.4 石蠟的更換

本科室的石蠟為4～5周更換1次，時(shí)間在更換酒精和二甲苯之后，同樣也是將第一道石蠟排出，將后續(xù)的石蠟一次向前挪，在最后一道中加入新的石蠟。氣溫高加入多一些的硬蠟，氣溫低加入多一些的軟蠟。石蠟更換也可憑技術(shù)人員的細(xì)心觀察而定，例如石蠟稀呈水樣，浸蠟不充分，并附著較大的二甲苯氣味，就應(yīng)該及時(shí)更換石蠟[14]。

3.5 沖洗

標(biāo)本取出后，及時(shí)沖洗。為了避免管道的堵塞和試劑的相互混合，沖洗液及水每周都需要更換。每天沖洗完畢，放入標(biāo)本處理缸先用紙巾將沖洗殘留液體擦干凈，避免沖洗液和AAF固定液的混合，影響固定效果。并且，將標(biāo)本處理缸的感應(yīng)探頭擦干凈，是感應(yīng)探頭準(zhǔn)確測量試劑的濃度，避免錯(cuò)報(bào)。每天排蠟完畢取出標(biāo)本時(shí)，應(yīng)用紙巾將標(biāo)本處理缸擦干凈再經(jīng)行沖洗，這樣可減少管道堵塞的機(jī)會。

3.6 脫水機(jī)責(zé)任到人

負(fù)責(zé)人負(fù)責(zé)試劑的更換和添置，每天放置標(biāo)本完畢之后檢查試劑的頁面是否正常，蠟缸是否需要添置。并做好相關(guān)問題的記錄，避免問題的發(fā)生。登記每天的蠟塊數(shù)，密切關(guān)注組織塊的脫水情況。

3.7 脫水機(jī)的定期保養(yǎng)和維護(hù)

蓋板密封圈表面和周圍有石蠟殘留，產(chǎn)生漏氣現(xiàn)象，要留意密封圈的密封性能，如有破損，及時(shí)更換。脫水機(jī)內(nèi)部的塑膠管道使用一年半左右需更換，以免破損導(dǎo)致機(jī)器停工[15]。過濾網(wǎng)有殘?jiān)剑噭┙粨Q受阻。要定期的清理。最好能夠定期請廠家為脫水機(jī)進(jìn)行故障的排查。

綜上，在日常工作中脫水機(jī)的正常運(yùn)行，試劑的濃度適宜，脫水的程序時(shí)間適中，才能將活檢組織脫水充分，成為制作優(yōu)質(zhì)病理切片最關(guān)鍵也是最基礎(chǔ)的一步。

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（收稿日期：2015-07-09）