Rad對心肌營養(yǎng)素1誘導心肌細胞肥大作用的實驗研究

劉玉峰，耿召華，牛麗麗

·論著·

Rad對心肌營養(yǎng)素1誘導心肌細胞肥大作用的實驗研究

劉玉峰，耿召華，牛麗麗

目的 探討小G蛋白Rad對心肌營養(yǎng)素1(CT-1)誘導心肌細胞肥大作用的影響。方法 2011年6月—2013年3月，選取新生健康雄性SD乳鼠60只。構(gòu)建載有Rad基因的腺病毒載體(Ad-Rad)、含有編碼綠色熒光蛋白基因的空白腺病毒載體(Ad-GFP)。取乳鼠心臟并剪碎，進行心肌細胞原代培養(yǎng)。采用隨機數(shù)字表法將提取的原代心肌細胞平均分為6組，即空白對照組〔轉(zhuǎn)染磷酸鹽緩沖液(PBS)，刺激物為PBS〕、Ad-GFP組(轉(zhuǎn)染Ad-GFP，刺激物為PBS)、Ad-Rad組(轉(zhuǎn)染Ad-Rad，刺激物為PBS)、CT-1對照組(轉(zhuǎn)染PBS，刺激物為CT-1)、Ad-GFP+CT-1組(轉(zhuǎn)染Ad-GFP，刺激物為CT-1)、Ad-Rad+CT-1組(轉(zhuǎn)染Ad-Rad，刺激物為CT-1)。轉(zhuǎn)染腺病毒載體48 h后，采用流式細胞儀檢測腺病毒載體轉(zhuǎn)染率，并采用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)法檢測Rad、心房鈉因子(ANF)、β肌球蛋白重鏈(β-MHC)mRNA表達水平，Western blotting法檢測Rad表達水平。結(jié)果 腺病毒載體轉(zhuǎn)染率為95.51%。Ad-Rad組Rad mRNA表達水平高于空白對照組、Ad-GFP組、CT-1對照組、Ad-GFP+CT-1組(P<0.05)；Ad-Rad+CT-1組Rad mRNA表達水平高于空白對照組、Ad-GFP組、CT-1對照組、Ad-GFP+CT-1組(P<0.05)。CT-1對照組、Ad-GFP+CT-1組ANF mRNA表達水平高于空白對照組、Ad-GFP組、Ad-Rad組(P<0.05)；Ad-Rad+CT-1組ANF mRNA表達水平低于空白對照組、Ad-GFP組、Ad-Rad組、CT-1對照組、Ad-GFP+CT-1組(P<0.05)。CT-1對照組、Ad-GFP+CT-1組β-MHC mRNA表達水平高于空白對照組、Ad-GFP組、Ad-Rad組(P<0.05)；Ad-Rad+CT-1組β-MHC mRNA表達水平低于CT-1對照組、Ad-GFP+CT-1組(P<0.05)。Ad-Rad組Rad表達水平高于空白對照組、Ad-GFP組、CT-1對照組、Ad-GFP+CT-1組(P<0.05)；Ad-Rad+CT-1組Rad表達水平高于空白對照組、Ad-GFP組、CT-1對照組、Ad-GFP+CT-1組(P<0.05)。結(jié)論 Rad具有負性調(diào)節(jié)CT-1誘導心肌細胞肥大的作用。

肥大；肌細胞,心臟；Rad；心肌營養(yǎng)素1；腺病毒

劉玉峰，耿召華，牛麗麗.Rad對心肌營養(yǎng)素1誘導心肌細胞肥大作用的實驗研究[J].中國全科醫(yī)學，2016，19(9)：1032-1036.[www.chinagp.net]

Liu YF,Geng ZH,Niu LL.Effect of Rad on myocardial cells hypertrophy induced by cardiotrophin-1[J].Chinese General Practice，2016，19(9)：1032-1036.

Rad(Ras associated with diabetes)是新近發(fā)現(xiàn)的小G蛋白，屬于RGK亞家族成員之一[1-2]。在心血管疾病中，小G蛋白對血管內(nèi)皮細胞的功能、血管平滑肌細胞的收縮、增殖、遷移以及心肌細胞肥大與凋亡的發(fā)生均具有調(diào)節(jié)作用[3]。Chang等[4]首次報道，小G蛋白Rad缺乏易導致心肌細胞肥大。但是Rad是否具有負性調(diào)節(jié)心肌營養(yǎng)素1(cardiotrophin-1，CT-1)誘導心肌細胞肥大作用的研究國內(nèi)外鮮見報道，故本研究以CT-1作為促心肌細胞肥大刺激因子，以心房鈉因子(atrialnatriuretic factor，ANF)、β肌球蛋白重鏈(β-MHC)mRNA表達水平作為心肌細胞肥大指標，研究Rad過表達對心肌細胞肥大過程中細胞內(nèi)ANF、β-MHC mRNA表達水平的影響，以探討Rad是否具有負性調(diào)節(jié)CT-1誘導心肌細胞肥大的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 2011年6月—2013年3月，選取新生健康雄性SD乳鼠60只，體質(zhì)量約20 g，鼠齡1～2 d，由第三軍醫(yī)大學第二附屬醫(yī)院實驗動物中心提供(許可證號：SYXK-軍2012-0011)。

1.2 主要試劑及設備 流式細胞儀(Beckman Coulter公司)，高糖DMEM培養(yǎng)基(HyClone公司)，CT-1(Gibico公司)，反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)試劑盒(Takara公司)，Rad抗體(Santa Cruz公司)，熒光顯微鏡(Olympus公司)，實時熒光定量PCR儀(ABI 7500)。

1.3 研究方法

1.3.1 構(gòu)建缺陷腺病毒載體 構(gòu)建載有Rad基因的腺病毒載體(Ad-Rad)、含有編碼綠色熒光蛋白基因的空白腺病毒載體(Ad-GFP)。

1.3.2 心肌細胞原代培養(yǎng) 取出新生SD乳鼠心臟并剪碎，采取分步消化法提取心肌細胞懸液，純化心肌細胞，用含有10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基置入CO2

本研究背景：

Rad是新近發(fā)現(xiàn)的小G蛋白，其生物學功能非常廣泛，包括參與細胞增殖、遷移，細胞骨架重排，細胞內(nèi)囊泡的轉(zhuǎn)運以及腫瘤癌基因的調(diào)節(jié)等。人類Rad基因在心血管系統(tǒng)的心肌細胞、內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞中均有表達，在骨骼肌、心臟和肺臟中表達水平較高。研究報道，小G蛋白Rad功能缺乏易導致心肌細胞肥大，提示Rad可能參與心肌細胞肥大的進展。

培養(yǎng)箱于37 ℃培養(yǎng)。

1.3.3 實驗分組及其處理方法 采用隨機數(shù)字表法將提取的原代心肌細胞平均分為6組，即空白對照組〔轉(zhuǎn)染磷酸鹽緩沖液(PBS)，刺激物為PBS〕、Ad-GFP組(轉(zhuǎn)染Ad-GFP，刺激物為PBS)、Ad-Rad組(轉(zhuǎn)染Ad-Rad，刺激物為PBS)、CT-1對照組(轉(zhuǎn)染PBS，刺激物為CT-1)、Ad-GFP+CT-1組(轉(zhuǎn)染Ad-GFP，刺激物為CT-1)、Ad-Rad+CT-1組(轉(zhuǎn)染Ad-Rad，刺激物為CT-1)。轉(zhuǎn)染腺病毒載體48 h后，熒光顯微鏡下觀察，用PBS清洗3遍，加入不含胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基，饑餓心肌細胞24 h，各組分別加入刺激物，培養(yǎng)48 h，PBS清洗3遍，裂解細胞并收集裂解細胞液。

1.3.4 檢測腺病毒載體轉(zhuǎn)染率 調(diào)整感染復數(shù)(multiplicity of infection，MOI)為20，分別轉(zhuǎn)染Ad-GFP、Ad-Rad腺病毒，48 h后，在激光共聚焦顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效果，并采用流式細胞儀檢測腺病毒載體轉(zhuǎn)染率。1.3.5 RT-PCR法檢測Rad、ANF、β-MHC mRNA表達水平 按RT-PCR試劑盒說明書合成cDNA，設計Rad、ANF、β-MHC mRNA的引物：Rad上游引物為5′-CGCATCTTTGGTGGAGTAGAA-3′，下游引物為5′-GCCCTTGTCCGTTATTGAGTA-3′，產(chǎn)物長度為201 bp；ANF上游引物為5′-AGGAGAAGATGCCGGTAGAG-3′，下游引物為5′-AGAGCCCTCAGTTTGCTTTCTT-3′，產(chǎn)物長度為211 bp；β-MHC上游引物為5′-TCCAGAAGAGAAGAACTCCATTT-3′，下游引物為5′-ATACTCGTTGCCCACTTTGACTAAT-3′，產(chǎn)物長度為205 bp。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參照，其上游引物為5′-ACAGCAACAGGGTGGTGGAC-3′，下游引物為5′-TTTGAGGGTGCAGCGAACT-3′，產(chǎn)物長度為252 bp。采用實時熒光定量PCR儀計算基因相對表達水平，空白對照組mRNA表達水平設定為1。實驗共重復3次，取平均值。1.3.6 Western blotting法檢測Rad表達水平 裂解各組心肌細胞，提取總蛋白，調(diào)整蛋白上樣量，使各組蛋白上樣量相等，在聚丙烯酰胺凝膠中電泳分離，然后轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜，5%胎牛血清清蛋白封閉1 h，用Rad一抗與聚偏二氟乙烯膜結(jié)合孵育過夜。洗膜后與辣根過氧化物酶標記的Rad二抗結(jié)合，室溫孵育1 h，經(jīng)化學發(fā)光法顯像。采用ODYSSEY 13.0掃描儀對膠片掃描成像，用Quantity One軟件對圖像進行吸光度分析，以目的條帶與內(nèi)參條帶信號強度比值代表心肌細胞中Rad表達水平。實驗共重復3次，取平均值。

2 結(jié)果

2.1 腺病毒載體轉(zhuǎn)染率 腺病毒載體轉(zhuǎn)染率為95.51%(見圖1～3，本文圖1、2彩圖見本刊官網(wǎng)www.chinagp.net電子期刊相應文章附件)。

圖1 倒置顯微鏡下心肌細胞(×100)

本研究創(chuàng)新點：

以腺病毒為目的基因的載體轉(zhuǎn)染心肌細胞，心肌營養(yǎng)素1(CT-1)作為促心肌細胞肥大刺激因子，心房鈉因子(ANF)、β肌球蛋白重鏈(β-MHC)mRNA表達水平作為心肌細胞肥大指標，研究Rad過表達對心肌細胞肥大過程中細胞內(nèi)ANF、β-MHC mRNA表達水平的影響，以探討Rad是否具有負性調(diào)節(jié)CT-1誘導心肌細胞肥大的作用。為探索Rad負性調(diào)節(jié)CT-1誘導心肌細胞肥大的分子機制提供重要線索，從而為心肌肥厚在臨床治療方面的研究提供了新的策略。

圖2 熒光顯微鏡下心肌細胞(×100)

圖3 流式細胞儀檢測腺病毒載體轉(zhuǎn)染率結(jié)果

2.2 各組Rad、ANF、β-MHC mRNA表達水平比較 各組Rad mRNA表達水平比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。Ad-Rad組Rad mRNA表達水平高于空白對照組、Ad-GFP組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；CT-1對照組、Ad-GFP+CT-1組Rad mRNA表達水平低于Ad-Rad組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；Ad-Rad+CT-1組Rad mRNA表達水平高于空白對照組、Ad-GFP組、CT-1對照組、Ad-GFP+CT-1組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見表1)。

各組ANF mRNA表達水平比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。CT-1對照組、Ad-GFP+CT-1組ANF mRNA表達水平高于空白對照組、Ad-GFP組、Ad-Rad組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；Ad-Rad+CT-1組ANF mRNA表達水平低于空白對照組、Ad-GFP組、Ad-Rad組、CT-1對照組、Ad-GFP+CT-1組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見表1)。

各組β-MHC mRNA表達水平比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。CT-1對照組、Ad-GFP+CT-1組β-MHC mRNA表達水平高于空白對照組、Ad-GFP組、Ad-Rad組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；Ad-Rad+CT-1組β-MHC mRNA表達水平低于CT-1對照組、Ad-GFP+CT-1組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見表1)。

Table 1 Comparison of mRNA expression levels of Rad,ANF and β-MHC among each group

組別RadmRNAANFmRNAβ?MHCmRNA空白對照組100±000100±000100±000Ad?GFP組098±005100±006096±019Ad?Rad組330±015ab107±008080±009CT?1對照組100±002c140±010abc246±020abcAd?GFP+CT?1組103±005c138±004abc204±016abcAd?Rad+CT?1組327±015abde085±003abcde080±004deF值5022903879337086P值<0001<0001<0001

注：Ad-GFP=含有編碼綠色熒光蛋白基因的空白腺病毒載體，Ad-Rad=載有Rad基因的腺病毒載體，CT-1=心肌營養(yǎng)素1，ANF=心房鈉因子，β-MHC=β肌球蛋白重鏈；與空白對照組比較，aP<0.05；與Ad-GFP組比較，bP<0.05；與Ad-Rad組比較，cP<0.05；與CT-1對照組比較，dP<0.05；與Ad-GFP+CT-1組比較，eP<0.05

2.3 各組Rad表達水平比較 各組Rad表達水平比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。Ad-Rad組Rad表達水平高于空白對照組、Ad-GFP組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；CT-1對照組、Ad-GFP+CT-1組Rad表達水平低于Ad-Rad組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；Ad-Rad+CT-1組Rad表達水平高于空白對照組、Ad-GFP組、CT-1對照組、Ad-GFP+CT-1組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見表2)。

表2 各組Rad表達水平比較

注：與空白對照組比較，aP<0.05；與Ad-GFP組比較，bP<0.05；與Ad-Rad組比較，cP<0.05；與CT-1對照組比較，dP<0.05；與Ad-GFP+CT-1組比較，eP<0.05

3 討論

Rad是新近發(fā)現(xiàn)的小G蛋白，是Maguire等[5]通過消減克隆方法在2型糖尿病患者的骨骼肌細胞中發(fā)現(xiàn)的，屬于RGK亞家族成員之一，該家族成員還包括Gem/kir、Rem、Rem2。人類Rad基因位于16號染色體q12[2]。Rad分子量為33～35 KDa[5-6]。小G蛋白家族均擁有一個共同的酶域，含170個氨基酸殘基，5個保守氨基酸序列，參與酶的結(jié)構(gòu)域與三磷酸核苷的識別、結(jié)合、水解、分離作用[7]。Rad的生物學功能非常廣泛，包括參與細胞增殖、遷移，細胞骨架重排，細胞內(nèi)囊泡的轉(zhuǎn)運以及腫瘤癌基因的調(diào)節(jié)等[8-10]。人類Rad基因在心血管系統(tǒng)的心肌細胞、內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞中均有表達，在骨骼肌、心臟和肺中表達水平較高[1-2,10]，這提示Rad可能參與心血管疾病的進展過程。Chang等[4]首次報道，小G蛋白Rad功能缺乏易導致心肌細胞肥大。然而，小G蛋白Rad是否具有負性調(diào)節(jié)CT-1誘導心肌細胞肥大作用的研究尚未見報道。CT-1最初是從心臟分離出的細胞因子，在心肌細胞凋亡、肥大中發(fā)揮重要作用，在體外可誘導心肌細胞肥大[11]。本研究利用腺病毒介導轉(zhuǎn)基因技術(shù)，在體外培養(yǎng)的乳鼠心肌細胞中過表達Rad基因，以CT-1作為促心肌細胞肥大刺激因子，以ANF、β-MHC mRNA表達水平作為心肌細胞肥大指標，結(jié)果顯示，腺病毒載體轉(zhuǎn)染率為95.51%，提示心肌細胞雖然為終末分化細胞，但通過同源重組構(gòu)建攜帶Rad目的基因的腺病毒載體，轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)的心肌細胞，可以高效地將目的基因Rad導入細胞內(nèi)。Ad-Rad組Rad mRNA及其蛋白表達水平高于空白對照組、Ad-GFP組、CT-1對照組、Ad-GFP+CT-1組，Ad-Rad+CT-1組Rad mRNA及其蛋白表達水平高于空白對照組、Ad-GFP組、CT-1對照組、Ad-GFP+CT-1組；CT-1對照組、Ad-GFP+CT-1組ANF mRNA表達水平高于空白對照組、Ad-GFP組、Ad-Rad組，Ad-Rad+CT-1組ANF mRNA表達水平低于空白對照組、Ad-GFP組、Ad-Rad組、CT-1對照組、Ad-GFP+CT-1組；CT-1對照組、Ad-GFP+CT-1組β-MHC mRNA表達水平高于空白對照組、Ad-GFP組、Ad-Rad組，Ad-Rad+CT-1組β-MHC mRNA表達水平低于CT-1對照組、Ad-GFP+CT-1組。表明Rad過表達對CT-1所誘導的心肌細胞肥大具有抑制作用，提示Rad具有負性調(diào)節(jié)CT-1誘導心肌細胞肥大的作用。

目前，對Rad負性調(diào)節(jié)CT-1誘導心肌細胞肥大的機制尚未完全闡明。研究顯示，Rad作為一種新型的內(nèi)源性調(diào)節(jié)因子，其與L-型鈣通道β亞單位相結(jié)合，調(diào)節(jié)電壓依賴型L-型鈣通道功能，調(diào)節(jié)心臟興奮收縮偶聯(lián)、腎上腺素受體信號傳導通路和抑制心律失常[2-3,12]。Chang等[4]利用腎上腺素刺激培養(yǎng)的乳鼠心肌細胞時發(fā)現(xiàn)，缺失Rad功能的心肌細胞在腎上腺素刺激下，更容易發(fā)生心肌細胞肥大，這表明Rad是一種新型的調(diào)節(jié)因子，其可能是通過激活(磷酸化)的鈣調(diào)蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)途徑負性調(diào)節(jié)CT-1誘導心肌細胞肥大的。這些研究為探索Rad負性調(diào)節(jié)CT-1誘導心肌細胞肥大的分子機制提供重要線索，從而為心肌肥厚在臨床治療方面的研究提供了新的策略。然而其具體分子機制還需要進一步研究。

本研究并未檢測肥大基因ANF、β-MHC表達水平，可能對結(jié)果有一定影響，今后將進一步完善。

綜上所述，Rad具有負性調(diào)節(jié)CT-1誘導心肌細胞肥大的作用。本研究結(jié)論為探索Rad負性調(diào)節(jié)CT-1誘導心肌細胞肥大的分子機制提供了重要線索，從而為心肌肥厚臨床治療方面的研究提供了新的策略。

作者貢獻：劉玉峰進行實驗設計與實施、資料收集整理、撰寫論文、成文并對文章負責；耿召華、牛麗麗教授指導標書及論文的書寫，并對文章質(zhì)量進行控制及審效。

本文無利益沖突。

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(本文編輯：崔麗紅)

Effect of Rad on Myocardial Cells Hypertrophy Induced by Cardiotrophin-1

LIUYu-feng,GENGZhao-hua,NIULi-li.DepartmentofCardiology,JiaxingFirstHospital,theFirstAffiliatedHospitalofJiaxingUniversity,Jiaxing314000,China

Objective To explore the effects of small G-protein Rad on cardiotrophin-1(CT-1)induced myocardial cells hypertrophy.Methods From June 2011 to March 2013,we selected 60 newborn healthy male SD rats.Ad-Radwith Rad genes and Ad-GFP containing gene encoding green fluorescent protein were made.Hearts were taken out from rats and were cut into pieces to conduct myocardial cell primary culture.Using random number table method,we divided the primary myocardial cells into 6 groups:blank control group〔transfection by phosphatebuffer solution(PBS) with PBS as irritant〕,Ad-GFP group(transfection by Ad-GFP with PBS as irritant),Ad-Rad group (transfection by Ad-Rad with PBS as irritant),CT-1 control group (transfection by PBS with CT-1 as irritant),Ad-GFP+CT-1 group (transfection by Ad-GFP with CT-1 as irritant) and Ad-Rad+CT-1group (transfection by Ad-Rad with CT-1as irritant).After adenovirus vector transfection for 48 hours,we detected transfection rate of adenovirus vector by flow cytometry,detected the mRNA expression levels of Rad,ANF and β-MHC by RT-PCR method and measured Rad expression by Western blotting method.Results The transfection rate of adenovirus vector was 95.51%.The expression level of Rad mRNA in Ad-Rad group was higher than that in control group,Ad-GFP group,CT-1 control group and Ad-GFP+CT-1 group(P<0.05);the expression level of Rad mRNA in Ad-Rad+CT-1 group was higher than that in control group,Ad-GFP group,CT-1 control group and Ad-GFP+CT-1 group (P<0.05).The expression level of ANF mRNA in CT-1 control group and Ad-GFP+CT-1 group was higher than that in control group,Ad-GFP group and Ad-Rad group (P<0.05);the expression level of ANF mRNA in Ad-Rad+CT-1 group was lower than that in control group,Ad-GFP group,Ad-Rad group,CT-1 control group and Ad-GFP+CT-1 group (P<0.05).The expression level of β-MHC mRNA in CT-1 control group and Ad-GFP+CT-1 group was higher than that in control group,Ad-GFP group and Ad-Rad group (P<0.05);the expression level of β-MHC mRNA in Ad-Rad+CT-1 group was lower than that in CT-1 control group and Ad-GFP+CT-1 group (P<0.05).The expression level of Rad in Ad-Rad group was higher than that in control group,Ad-GFP group,CT-1 control group and Ad-GFP+CT-1 group(P<0.05);the expression level of Rad in Ad-Rad+CT-1 group was higher than that in control group,Ad-GFP group,CT-1 control group and Ad-GFP+CT-1 group (P<0.05).Conclusion Rad down-regulates the hypertrophic response of myocardial cells induced by CT-1.

Hypertrophy;Myocytes,cardiac;Rad;Cardiotrophin-1;Adenoviruses

國家自然科學基金資助項目(81070093)；重慶市科技攻關計劃項目(CSTC，2011AC5031)

314000 浙江省嘉興市第一醫(yī)院 嘉興學院附屬第一醫(yī)院心血管內(nèi)科(劉玉峰)；第三軍醫(yī)大學第二附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科(耿召華)；北京軍區(qū)總醫(yī)院心血管內(nèi)科(牛麗麗)

耿召華，400037重慶市，第三軍醫(yī)大學第二附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科；E-mail：gengzhh@tom.com

R 542.2 R 364.3

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2016.09.010

2015-05-30；

2016-01-05)