兩種血小板濃縮物修復兔硬腭軟組織缺損的形態學觀察

何婷婷,王 拓,陳紅亮,孫 勇

·論著·

兩種血小板濃縮物修復兔硬腭軟組織缺損的形態學觀察

何婷婷,王 拓,陳紅亮,孫 勇

目的對比觀察兩種血小板濃縮物修復兔硬腭軟組織缺損的形態學效果,評價其臨床應用價值。方法將54只日本大耳白兔隨機分為A、B、C 3組,于兔硬腭前部中份制備軟組織缺損模型,缺損區分別植入自體改良型富血小板纖維蛋白(A-PRF)膜(A組)、自體富血小板纖維蛋白(PRF)膜(B組)或不做任何處理(C組),分別于術后 3、7、11、15、21、28 d行形態學觀察,計算創面愈合率。結果(1)形態學觀察：術后 7 d內,A組和B組創面炎性反應輕微,A組更優,C組炎癥反應明顯。術后15 d,A組和B組無顯著差異,創面黏膜上皮覆蓋完整,均無組織凹陷,無瘢痕形成;C組在愈合過程中出現了不同程度的組織凹陷,有瘢痕組織形成。(2)創面愈合率：術后 3 d,3組無明顯差異(P>0.05);術后 7、11 d,A組與B組之間無明顯差異(P>0.05),A組和B組均明顯高于C組(P<0.05)。結論APRF、PRF均能減輕創傷區域的炎癥反應,減少瘢痕形成,加速創面愈合。

血小板濃縮物;軟組織缺損;形態學觀察;創面愈合率

軟組織缺損的重建是口腔種植臨床上經常面對的難題。外科手段、生物學和組織工程材料等常被應用于口腔臨床軟組織重建中[1-3］。外科手段一般需開辟第二術區,增加患者痛苦。有價值的生物細胞及生長因子等則需要在嚴格的無菌培養環境中進行較長時間的培養才能獲得。人體血小板濃縮物(platelet concentration,PC)中含有大量能促進骨和軟組織再生的生長因子[4］,且可快速有效地獲得組織重建細胞,避免使用昂貴的外源性生長因子,免去復雜手術的痛苦,亦更安全可靠。

Choukroun等[5］發現并制備的第二代血小板濃縮物-富血小板纖維蛋白(platelet-rich fibrin,PRF),臨床和動物實驗證實其具有促進軟組織再生的作用[6-8］。Ghanaati等[9］于2014年提出了一種與PRF離心速度和時間不同的改良型富血小板纖維蛋白(advanced platelet-rich fibrin,A-PRF),具有比PRF總量更高、更豐富的生長因子。但A-PRF較之PRF是否具有更好的促進口腔軟組織再生的能力,尚待大量臨床和動物實驗證實。本研究在兔硬腭區制備軟組織缺損模型,對比觀察兩者促進軟組織愈合的效果,為其臨床應用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 54只雄性3月齡健康日本大耳白兔,2.0～2.5 kg,由四川省成都達碩實驗動物中心提供及飼養管理,生產許可證號：SYXK(川)2014～189。所有動物均先在同一條件下適應性分籠喂養1 w。實驗過程均按照動物倫理學要求進行各項處置。

1.2 實驗材料 PRF真空無菌采血管(5 ml),APRF真空無菌采血管(10 ml)(江蘇創英醫療器械有限公司);TDZ4-WS低速離心機(中國湘儀集團);纖維蛋白成型處理工具盒(法國Process,Nice);Surgic XT Plus種植機(日本NSK);Ti-SG20L種植手機(日本NSK);5.0 mm組織環切鉆(MCT,韓國);普通透明薄膜等。

1.3 方法 54只日本大耳白兔隨機分為A、B、C 3組,每組18只。隨機選取實驗動物,稱重后固定,使用A-PRF/PRF專用離心管通過兔耳中央動脈采集4 ml血液,迅速離心：A-PRF(2000 r/min,24 min)、PRF(3250 r/min,10 min)。離心后靜置3～5 min,棄去上清液,用無菌有齒鑷取出中間層凝膠,修剪并保留其下部少許紅細胞層后,置于專用工具盒中壓制成膜備用。

按1 ml/kg沿兔耳緣靜脈緩慢推注3%戊巴比妥鈉,麻醉起效后,將其以仰臥位固定于手術臺,常規消毒鋪巾;于兔硬腭前部中份制備直徑5 mm軟組織缺損(環切鉆中心點位于距上頜后排門齒4.5 mm的硬腭中線處),剝離黏骨膜露出骨面,充分止血。分別于A、B兩組動物軟組織缺損處填入按缺損大小修剪后的A-PRF膜或PRF膜,縫合固定。C組軟組織缺損經充分止血后,不做任何處理。

術后連續3 d肌注青霉素鈉(10萬U/kg,1次/d),食軟食1 w。口內縫線任其自然脫落。

1.4 觀察指標 分別于術后3、7、11、15、21、28 d行大體形態觀察。使用透明薄膜描記創面大小后,修剪成創面大小并稱重,以薄膜的重量來反映創面面積。創面愈合率=(原始創面面積-未愈合創面面積)/原始創面面積[10］。

1.5 統計學方法 應用 SPSS 23.0統計軟件分析,計量資料以±s表示,采用單因素方差分析,P< 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 形態學觀察 術后3 d,A、B兩組縫線均未脫落,A-PRF膜及PRF膜均穩固附著于創面,且有少量吸收,創面輕度紅腫;C組創緣紅腫明顯,可見新鮮肉芽組織,觸之點狀出血。術后 7 d,A、B兩組肉眼見膜基本吸收,創面縫線大部分自行脫落,A組創面無明顯炎癥及紅腫反應,B組尚見輕微紅腫,兩組愈合面積均達原創面面積的1/2;C組創面紅腫仍明顯,呈凹陷缺損。術后11 d,A、B組愈合面積達原創面積的 4/5;C組創面基底也可見黏膜上皮覆蓋,仍可見明顯組織凹陷。術后15 d,A、B組創面上皮覆蓋基本完成,質地較軟,色澤欠紅潤,未見明顯瘢痕組織;C組創面仍呈凹陷狀,創面邊緣有瘢痕形成。術后21 d,A、B兩組創面黏膜色澤、質地均與正常黏膜無明顯差異,且A組更優;C組仍存少量組織凹陷,瘢痕組織明顯。術后28 d,C組見明顯瘢痕組織,未見組織凹陷。

2.2 創面愈合率 在術后3 d,各組創面愈合率無統計學差異(P>0.05);術后 7、11 d,A組與B組的創面愈合率無顯著差異,但均較C組更高(P< 0.05)。在術后15、21、28 d,A組及B組創面愈合率為100%。在各時間節點,A組創面愈合率均最高,B組次之,C最低。見表1。

表1 各組不同時間點創面愈合率的比較(n=18)

3 討論

創傷后的組織愈合大致經歷止血期、炎性反應期、肉芽形成期、組織重塑期4個階段[10］,主要包括機體抵御炎性反應、血管新生、結締纖維組織形成幾個方面。當損傷發生后,血小板迅速在創面局部聚集形成血凝塊,同時,血小板被活化后脫顆粒釋放各種生長因子,這些生長因子能夠促進大量中性粒細胞、單核/巨噬細胞在創傷區聚集浸潤,釋放大量炎性介質, 如白細胞介素(1L-1、1L-4、1L-6)、TNF-α等,吞噬殺滅細菌、清除創面的壞死組織及碎屑,發揮著抗炎、抗感染的免疫作用[12］。各種生長因子與纖維蛋白結合可促進與軟組織愈合相關的環節,成纖維細胞不斷成熟,并繼續增殖分化,在相關生子因子作用下不斷合成膠原纖維,損傷區被結締纖維組織、新生血管及上皮組織等組織覆蓋,從而具有一定強度,最終形成穩定的瘢痕[13-14］。總之,血小板及其釋放的各種生長因子在創傷愈合各階段都很重要[15］。

PRF凝膠中富含全血中約97%的血小板及＞50%的白細胞,具有與血凝塊結構類似的疏松三維立體纖維蛋白網狀結構,能夠為細胞的遷移、附著及增殖分化提供支架,血小板及白細胞如黏結劑一樣嵌入其中,各種細胞因子被滯留于其中緩慢節律性釋放[12,16］。A-PRF與PRF制備的離心速度及時間不同,由＞97%的血小板及少量血細胞組成,呈疏松三維立體網狀結構,具有比PRF總量更高的血小板和白細胞[9］。Eizaburo等將PRP、PRF和A-PRF行體外溫育培養,評估15 min、60 min、8 h、1 d、3 d、10 d時生長因子的釋放情況,采用ELISA定量分析PDGF-AA、PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB、TGFB1、VEGF、EGF、IGF等生長因子的釋放量,結果3種血小板濃縮物中釋放最多的生長因子依次是PDGF-AA、PDGF-BB、TGFB1、VEGF和PDGF-AB,溫育15～60 min,PRP釋放的生長因子顯著高于PRF和A-PRF,60 min后至第10 d,A-PRF釋放的總生長因子及血清總蛋白量最高,可長期穩定高效地釋放生長因子[4］。

本實驗形態學觀察顯示,在創傷愈合早期(術后7 d內),C組的炎性反應明顯較A組及B組嚴重,而A組與B組相比,前者紅腫炎癥程度相對較輕,說明APRF與PRF均有一定的抗炎能力,但在創傷愈合早期(術后7 d內),A-PRF抗炎效果更好。而在創傷愈合中后期,APRF與PRF抗炎效果相當,這與二者的生長因子釋放特點基本吻合。

本實驗僅通過形態學肉眼觀察創面愈合情況,分析各組的創面愈合率,初步評估創面愈合質量,尚待后續通過HE染色、Masson染色、CD105免疫組化染色等對各組的炎性反應、新生血管化、膠原的合成與降解進行量化比較,進一步評估創面愈合質量。

[1］Ghanaati S,Orth C,Unger RE,et al.Fine-tuning scaffolds for tissue regeneration:effects of formic acid processing on tissue reaction to silk fibroin[J］.J Tissue Eng Regen Med,2010,4(6): 464-472.

[2］Ghanaati S,Schlee M,Webber MJ,et al.Evaluation of the tissue reaction to a new bilayered collagen matrix in vivo and its translation to the clinic[J］.Biomed Mater,2011,6(1):15010.

[3］Penarrocha-Diago M,Gomez-Adrian MD,Balaguer-Martinez J,et al.Mandibular connective tissue pedicle flapsin implant dentistry:report of three cases[J］.J Oral Implantol,2007,33(3): 127-132.

[4］KobayashiE,FlückigerL,Fujioka-KobayashiM,etal. Comparative release of growth factors from PRP,PRF,and advanced-PRF[J］.Clin Oral Investig,2016,2:25.

[5］Choukroun J,Adda F,Schoeffler C,et al.Une opportunite’en paro-implantologie:le PRF[J］.Implantodontie.2000,42:55-62.

[6］Simonpieri A,Del C M,Sammartino G,et al.The relevance of Choukroun's platelet-rich fibrin and metronidazole during complex maxillary rehabilitations using bone allograft.Part I:a new grafting protocol[J］.Implant Dent,2009,18(2):102-111.

[7］Peck MT,Marnewick J,Stephen L.Alveolar ridge preservation using leukocyte and platelet-rich fibrin:a report of a case[J］. Case Rep Dent,2011,11:345-348.

[8］Toffler M,Toscano N,Holtzclaw D,etal.Introducing Choukroun's platelet rich fibrin (PRF)to the reconstructive surgery milieu[J］.The Journal of Implant and Advanced Clinical Dentistry,2009,1(6):21-32.

[9］Ghanaati S,Booms P,Orlowska A,et al.Advanced platelet-rich fibrin:a new concept for cell-based tissue engineering by means of inflammatory cells[J］.J Oral Implantol,2014,40(6):679-689.

[10］孫同柱,付小兵,顧小曼,等.重組人表皮生長因子促進兔燙傷創面愈合的實驗研究[J］.實驗動物科學與管理,2000,4:12-14.

[11］羅曉丁,李丹,張劍明.富血小板纖維蛋白促進組織愈合機制的探討[J］.中國口腔種植學雜志,2011,4:198-200.

[12］Dohan DM,Choukroun J,Diss A,et al.Platelet-rich fibrin(PRF): a second-generation platelet concentrate.PartⅡ:platelet-related biologic features[J］.Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod,2006,101(3):e45-e50.

[13］Bradley P,Brockbank J.The temporalis muscle flap in oral reconstruction.A cadaveric,animal and clinical study[J］.J Maxillofac Surg,1981,9(3):139-145.

[14］馮航,陳仲偉,潘朝斌.腭黏骨膜組織瓣轉移修復頰黏膜缺損的臨床應用研究[J］.中國誤診學雜志,2008,27:6556-6558.

[15］Desai CB,Mahindra UR,Kini YK,et al.Use of platelet-rich fibrin over skin wounds:modified secondary intention healing[J］. J Cutan Aesthet Surg,2013,6(1):35-37.

[16］Choukroun J,Diss A,Simonpieri A,et al.Platelet-rich fibrin (PRF):a second-generation platelet concentrate.PartⅣ:clinical effects on tissue healing[J］.Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod,2006,101(3):e56-e60.

Morphological observation on two kinds of PC in repair of rabbit hard palate soft tissue defects

He Tingting1,2,Wang Tuo3,Chen Hongliang2,Sun Yong1,21.Medical College of Stomatology,Southwest Medical University,Luzhou, Sichuan,646000,China;2.Department of Stomatology,the Institutional Hospital of Chengdu Military Command,Chengdu,Sichuan, 610011,China;3.Department of Stomatology,Affiliated Hospital of North Sichuan Medical College,Nanchong,Sichuan,637000, China

ObjectiveTo compare the morphological observation of two kinds of platelet concentration (PC)in repair of rabbit hard palate soft tissue defects and evaluate the clinical application value.MethodsA total of 54 Japanese big ear white rabbits were selected and randomly divided into groups A,B and C.Soft tissue defect models were made in rabbit hard palate.A-PRF membrane and PRF membrane were implanted into the defects in groups A and B respectively.The defects in group C were not treated.The morphology was observed three,seven,11,15,21,28 days after the treatment to calculate the wound healing rate.Results(1) Morphological observation:seven days after the operation,there was minor wound inflammatory response in groups A and B.Group A was better.Inflammatory response in group C was obvious.15 days after the operation,there was no significant difference between groups A and B.The mucosal epithelial cover was complete without tissue depression or cicatrization,and there was tissue depression at varying degrees and cicatrization in the process of healing in group C.(2)Wound healing rate:three days after the operation,there was no significant difference among the three groups(P>0.05).Seven and 11 days after the operation,there was no significant difference between groups A and B(P>0.05),and the wound healing rate in groups A and B was much higher than that in group C (P<0.05).ConclusionBoth APRF and PRF can relieve the inflammatory response in wound area,reduce scar formation,and accelerate the wound healing.

PC;soft tissue defect;morphological observation;wound healing rate

R 782.22

A

1004-0188(2016)11-1225-03doi:10.3969/j.issn.1004-0188.2016.11.001

2016-06-30)

成都軍區“十二五”科研面上項目(C14050)

646000四川瀘州,西南醫科大學口腔醫學院(何婷婷,孫 勇);成都軍區機關醫院口腔科(何婷婷,陳紅亮,孫 勇);川北醫學院附屬醫院口腔科(王 拓)

孫 勇,電話：028-86687041